[Người Nuôi Tôm] – Nghiên cứu của Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM cho thấy Vibrio spp. gây tổn thương mô học tương tự tôm mắc hội chứng phân trắng, dù không xuất hiện triệu chứng, cần nghiên cứu sâu hơn để xác định tác nhân chính gây bệnh.

Nghiên cứu dưới đây của Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM do nhóm tác giả Nguyễn Hữu Thịnh và cộng sự thực hiện đã xác định khả năng gây bệnh của một số chủng Vibrio spp. phân lập từ tôm mắc hội chứng phân trắng (WFS) thông qua thí nghiệm gây bệnh, phân tích mô học và đánh giá độc lực (LD₅₀).

 

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (EHP, WSSV, AHPND) được thuần dưỡng ở độ mặn 15 ppt và mẫu tôm bị hội chứng phân trắng thu thập từ 7 hộ nuôi tại Bến Tre và Trà Vinh, có định danh mô học. Ba chủng vi khuẩn được sử dụng gồm VP.BT17S (V. parahaemolyticus) có khuẩn lạc xanh đều, rìa trắng, đường kính 2 mm; VA.ST4S (V. alginolyticus) có khuẩn lạc vàng, đường kính 3 mm; và VP.BL1S (V. parahaemolyticus) có khuẩn lạc xanh, tâm đậm, đường kính 2,5 mm. Thiết bị và hóa chất phục vụ thí nghiệm bao gồm nguồn nước mặn 15 ppt đã khử chlorine, bổ sung Sodium bicarbonate để tăng kiềm lên 160 ppm; các thiết bị như máy ly tâm, tủ ủ vi khuẩn, PCR, máy vortex, tủ hút, kính hiển vi, máy đo chất lượng nước; hóa chất Davidson, thuốc nhuộm HE, kit IQ2000, test Sera (NH4⁺, NO2^–); môi trường nuôi cấy TCBS, TSA, TSB, Chromagar; và cặp mồi định danh 27F – 1492R theo Frank et al. (2008).

 

Nội dung và quy trình nghiên cứu

Nghiên cứu gồm hai phần chính. Ở phần một, nhóm tác giả xác định LD₅₀ của vi khuẩn bằng cách gây nhiễm cho tôm thẻ chân trắng khỏe mạnh (PL15 – PL20) thông qua phương pháp ngâm trong bể (20 con/bể, lặp lại 3 lần). Tôm được cho ăn thức ăn 40% protein với khẩu phần 5% trọng lượng thân, 2 lần mỗi ngày. Các chỉ tiêu môi trường như nhiệt độ, pH, DO, TAN, nitrite và độ kiềm được theo dõi thường xuyên. Tỷ lệ chết sau 10 ngày được dùng để tính LD₅₀ theo phương pháp Reed & Muench (1938).

Phần hai là thí nghiệm gây bệnh và phân tích mô học. Vi khuẩn được phân lập trên môi trường TCBS, mô tả khuẩn lạc, ly trích DNA và định danh bằng PCR kết hợp giải trình tự gen 165 rRNA. Mỗi ngày, nhóm nghiên cứu lấy ngẩu nhiên 2 con tôm/bể để thu mẫu gan tụy, sau đó xử lý theo quy trình mô học: đúc paraffin, cắt lát 4 – 5 µm, nhuộm HE. Mô bệnh được phân tích dựa theo phương pháp Lightner (1996) và Susina cùng cộng sự (1986) để phân loại tổn thương. Dữ liệu được tính toán bằng Excel, phân tích LD₅₀ trên biểu đồ đường chuẩn và thực hiện ANOVA một chiều bằng phần mềm SPSS với mức tin cậy 95%.

 

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chất lượng nước bể thí nghiệm

Do thí nghiệm gây bệnh (bằng phương pháp ngâm) chỉ theo dõi trong 10 ngày nên các chỉ tiêu chất lượng nước không thay đổi nhiều.

Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trường cho thấy chất lượng nước trong thời gian theo dõi của cả 2 thí nghiệm đều phù hợp với khả năng thích nghi của tôm.

 

Kết quả khảo sát LD₅₀

Nghiệm thức có tôm chết cao nhất là nghiệm thức có mật độ vi khuẩn trong nước 10⁷ CFU/mL với tỷ lệ chết trung bình gây ra 63,33% sau 10 ngày cảm nhiễm, tiếp sau đó là nghiệm thức 10⁶ CFU/mL với tỷ lệ chết là 51,67%. Hai nghiệm thức 6,25 x 10⁵ CFU/ mL và nghiệm thức 6,25 x 10⁴ CFU/mL có tỷ lệ tôm chết trung bình bằng nhau là 36,67%. Qua đó có thể nhận định rằng tuy không gây chết cấp tính nhưng chủng khuẩn V. alginolyticus VA.ST45 vẫn có độc lực, làm tôm chết rải rác.

LD₅₀ của chủng vi khuẩn VA.ST4S: 3,85 x 10⁶ CFU/mL.

Khác với 2 chủng vi khuẩn trên, mặc dù kết quả gây nhiễm chủng VP.BL1S. (V. parahaemolyticus) tỷ lệ chết trung bình giữa các nghiệm thức và đối chứng âm có sự khác biệt nhưng không quá lớn, đặc biệt không có nghiệm thức nào tỷ lệ chết trung bình vượt quá 50%.

 

Dấu hiệu bệnh lý

Tôm có dấu hiệu bỏ ăn, gan tụy tôm teo lại và chuyển sang màu vàng hoặc nâu nhạt, phân tôm chuyển sang màu nâu, dãy phân đứt khúc. Phù hợp với dấu hiệu bệnh lý của tôm bị hội chứng phân trắng được mô tả trong thí nghiệm của Siriporn và ctv. (2014).

Nguyên nhân của hội chứng phân trắng trên tôm rất phức tạp (Natthinee và ctv., 2022). Hội chứng phân trắng là sự kết hợp của Vibrio spp. và EHP (Natthinee và ctv., 2022), hay giữa Vibrio spp. với nhau (Trương Minh Út và ctv., 2021). Từ đó có thể thấy Vibrio spp. đơn loài có thể chỉ là yếu tố cộng gộp của hội chứng phân trắng, nên khi gây bệnh đơn loài sẽ không xuất hiện phân trắng.

 

Phân lập và định danh vi khuẩn

Từ mẫu tôm có dấu hiêu bệnh lý ban đầu phân lập được 5 chủng vi khuẩn tương ứng như sau: VP.BT17S 2 chủng, VA.ST4S 1 chủng, VP.BL1S 2 chủng. Khi so sánh hình thái khuẩn lạc và kết quả giải trình tự đều cho sự tương đồng so với khuẩn gây bệnh ban đầu.

 

Kết quả phân tích mô học

Phân tích mô học cho thấy các mẫu tôm đối chứng dương có nhiều biến đổi nghiêm trọng như bong tróc lớp vi nhung mao, xuất hiện thể ATM trong ống gan tụy, teo ống, thoái hóa, hoại tử, giảm tế bào B, E, F, R, xâm nhập tế bào máu, đốm melanin, xơ hóa và các ống gan tụy tách xa nhau. Ở nhóm tôm gây bệnh, kết quả mô học tương tự đối chứng dương. Đặc biệt, với chủng vi khuẩn VP.BT17S, sau 24 giờ, 50% mẫu ở giai đoạn tổn thương nặng (G4), nhưng từ 48 giờ trở đi, tổn thương chủ yếu ở mức độ G2 – G3 và có xu hướng giảm dần về sau.

Một số hình ảnh về biến đổi mộ học của mẫu tôm gây nhiễm chủng vi khuẩn VP.BT17S

Kết quả cho thấy, ở nghiệm thức VA.ST4S, tôm chủ yếu tổn thương ở giai đoạn G2 trong thời gian đầu, nhưng từ 72 giờ trở đi, tổn thương nặng G3 – G4 xuất hiện nhiều hơn. Đến cuối thí nghiệm, mức độ tổn thương giảm nhưng vẫn chủ yếu ở G2. Với chủng VP.BL1S, tổn thương nặng bắt đầu tăng từ 72 giờ nhưng chỉ dừng lại ở mức G3, không ghi nhận tổn thương G4. Đối với VP.BT17S, tôm bị tổn thương nặng nhất trong 24 – 48 giờ đầu sau gây bệnh; từ 72 giờ trở đi, mức độ tổn thương giảm dần và đến cuối thí nghiệm, tổng điểm tổn thương không còn khác biệt so với đối chứng âm. Riêng VA.ST4S, sau 24 giờ gây bệnh, tôm có tổn thương nhẹ (tổng điểm 21,17b), cao hơn đối chứng âm nhưng không có khác biệt thống kê. Tổn thương đạt đỉnh từ 72 – 120 giờ với tổng điểm 35,17cC ± 5,64, sau đó giảm đáng kể vào 144 giờ, còn 19,50bA ± 5,69, nhưng vẫn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm.

Một số hình ảnh về biển đổi mô học của mẫu tôm gây nhiễm chủng vi khuẩn VP.BLIS (tt) 

Chủng vi khuẩn VP.BL1S bắt đầu gây tổn thương tế bào gan tụy của tôm sau 24 giờ gây bệnh, mức độ nặng nhất ghi nhận từ 48 đến 120 giờ. Sau giai đoạn này, tôm có dấu hiệu hồi phục và đến cuối thí nghiệm, tổng điểm tổn thương không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm.

Kết quả cho thấy, mô học của các nghiệm thức gây bệnh tương tự mẫu thực địa, dù không xuất hiện triệu chứng phân trắng. Đáng chú ý, thể ATM cũng được phát hiện ở mẫu đối chứng âm, cho thấy ATM không chỉ xuất hiện ở tôm bị hội chứng phân trắng mà còn có thể thấy ở tôm khỏe, nhưng mức độ tổn thương thấp – phù hợp với kết quả nghiên cứu của Natthinee và cộng sự (2022).

Do đó, cần thực hiện các thí nghiệm gây bệnh kết hợp giữa các chủng Vibrio và/hoặc vi bào tử trùng EHP để làm rõ mối quan hệ nhân quả với hội chứng phân trắng, đồng thời nên áp dụng kỹ thuật metagenomics để xác định hệ vi sinh vật đặc trưng và loài vi khuẩn tiềm năng gây bệnh chính trong mẫu thực địa mắc WFS.

Phương Nhung