[Người Nuôi Tôm] – Các nghiên cứu gần đây đã áp dụng nhiều công cụ phân tích như transcriptome, proteome, metabolome và microbiome để tìm hiểu cơ chế gây hại của EHP đối với tôm. Kết quả cho thấy, EHP không chỉ kích hoạt hệ miễn dịch quá mức mà còn làm rối loạn nghiêm trọng quá trình trao đổi chất, đặc biệt là chuyển hóa năng lượng và dinh dưỡng. Sự thay đổi đáng kể trong thành phần vi khuẩn đường ruột, cùng với mất cân bằng hormone và rối loạn chuyển hóa, là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng chậm lớn ở tôm.

 

Giải mã khả năng kháng bệnh của tôm qua phân tích gen gan tụy

Gan tụy đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch và trao đổi chất của tôm, đồng thời là cơ quan chính bị ảnh hưởng bởi EHP. Việc nghiên cứu gan tụy thông qua phân tích phiên mã là rất cần thiết để làm rõ các cơ chế cơ bản liên quan đến khả năng kháng EHP của tôm. Nghiên cứu gần đây từ Đại học Ninh Ba (Trung Quốc) đã so sánh phản ứng phiên mã trong gan tụy giữa tôm nhiễm EHP và tôm kháng EHP. Một số gen với mức độ biểu hiện khác nhau đã được xác định, có thể liên quan đến khả năng dễ bị hoặc kháng EHP của tôm.

Để phân biệt và theo dõi các dòng tôm trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật tiêm màu huỳnh quang vào tôm. Sau đó, chọn ra 15 dòng tôm không có sự khác biệt về trọng lượng ban đầu để tiến hành thí nghiệm. Các dòng tôm này được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn và chia thành hai nhóm: nhóm đối chứng (không nhiễm bệnh) và nhóm bị nhiễm bệnh EHP. Nhóm bị nhiễm được tiếp xúc với tôm đã nhiễm EHP để gây bệnh. Sau 60 ngày, các nhà khoa học đã so sánh sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và mức độ nhiễm EHP giữa các dòng tôm.

Sự thay đổi trong tải lượng EHP ở các dòng tôm kháng và dễ bị nhiễm sau khi nhiễm EHP được phát hiện thông qua kỹ thuật PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực, dựa trên trình tự bảo tồn của gen rRNA 18S của EHP (Hình 1).

Bốn nhóm tôm được phân loại như sau: tôm dễ bị nhiễm EHP (S4104-D), tôm kháng bệnh nhưng không nhiễm EHP (R4029-D), tôm dễ bị nhiễm EHP (S4104-G) và tôm kháng bệnh nhưng lại nhiễm EHP (R4029-G). Để xem xét sự biến đổi giữa các cá thể, gan tụy của ba con tôm được thu thập để làm mẫu phiên mã, với mỗi nhóm có ba mẫu phiên mã sao chép.

Hình 1. Sơ đồ minh họa của giao thức thử nghiệm

 

Đánh giá các họ tôm dễ nhiễm và kháng EHP của tôm

Các thông số được xem xét bao gồm tỷ lệ sống, chiều dài và trọng lượng cuối cùng, tỷ lệ tăng trọng và thông tin phả hệ. Nhóm tôm 4029 được xác định là kháng bệnh (R4029), trong khi nhóm 4104 dễ bị nhiễm bệnh (S4104). Chiều dài trung bình của tôm R4029 nhiễm EHP là 7,32 cm, trọng lượng trung bình là 6,82 g, với tỷ lệ sống đạt 83,33% và tỷ lệ tăng trọng là 606,60%. Ngược lại, chiều dài trung bình của tôm S4104 nhiễm EHP là 5,92 cm, trọng lượng trung bình là 3,45 g, với tỷ lệ sống chỉ đạt 33,33% và tỷ lệ tăng trọng là 464,76%.

Để xác định sự hiện diện của EHP trong các nhóm nhiễm, các tác giả đã thực hiện phân tích PCR định lượng thời gian thực. Kết quả cho thấy EHP có mặt ở cả hai nhóm, với nhóm dễ nhiễm (S4104-G) có tải lượng EHP cao hơn đáng kể so với nhóm kháng (R4029-G). Kết quả này được xác nhận qua ba bản sao cho mỗi nhóm, đảm bảo độ tin cậy trong đánh giá tải lượng mầm bệnh.

 

Giải phẫu bệnh học

Quan sát kết quả dưới kính hiển vi cho thấy, tôm dễ nhiễm bệnh (S4104) bị tổn thương gan tụy và ruột nghiêm trọng hơn nhiều so với tôm kháng bệnh (R4029) sau khi nhiễm bệnh EHP. Gan tụy của tôm dễ nhiễm bệnh teo nhỏ, các ống tuyến bị phá hủy, trong khi ruột bị tổn thương nặng nề. Điều này giải thích tại sao tôm dễ nhiễm bệnh lại chết nhiều hơn và tăng trưởng chậm hơn.

Hình 2. Nhuộm HE các phần mô tôm (A, gan tụy; B, ruột). C: Điểm số Chiu được sử dụng để đánh giá mức độ tổn thương niêm mạc ruột

Bảng 1. Phân loại điểm tổn thương niêm mạc ruột

 

Đánh giá chất lượng và giải trình tự transcriptome

Từ gan tụy của tôm, các nhà khoa học đã tạo ra 12 thư viện gen và giải mã chúng bằng công nghệ hiện đại. Kết quả cho thấy, thu được hơn 78 tỷ cặp base dữ liệu chất lượng cao. Dữ liệu này đã được lưu trữ và công khai để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

 

Xác định các gen biểu hiện khác biệt trong mỗi phép so sánh

Nghiên cứu này đã so sánh các gen hoạt động khác nhau giữa hai nhóm tôm: nhóm dễ nhiễm bệnh (S4104) và nhóm kháng bệnh (R4029) khi bị nhiễm vi khuẩn EHP. Kết quả cho thấy, hàng nghìn gen hoạt động khác nhau giữa hai nhóm tôm này. Khi phân tích sâu hơn, các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng những gen khác biệt này chủ yếu liên quan đến các quá trình chuyển hóa trong cơ thể tôm, đặc biệt là quá trình chuyển hóa các axit amin và các chất lạ. Điều này cho thấy, khi bị nhiễm bệnh, tôm dễ nhiễm bệnh và tôm kháng bệnh có những phản ứng khác nhau ở cấp độ gen, dẫn đến những hậu quả khác nhau về sức khỏe.

 

Các gen biểu hiện khác biệt được chia sẻ trong hai phép so sánh

Phân tích biểu đồ Venn cho thấy, có tổng cộng 664 DEG được chia sẻ giữa hai nhóm so sánh: S4104-D và R4029-D, cùng với S4104-G và R4029-G. Các thuật ngữ GO nổi bật liên quan đến quá trình chuyển hóa axit amin alpha, axit amin thơm, axit amin tế bào và kitin, cũng như vùng ngoại bào. Phân tích KEGG cho thấy năm con đường chính bao gồm phagosome, chuyển hóa cysteine và methionine, chuyển hóa vitamin B6, chuyển hóa phenylalanine và chuyển hóa glycine, serine và threonine. Ngoài ra, sáu con đường chung giữa các nhóm so sánh được xác định, bao gồm phagosome và các quá trình chuyển hóa khác.

 

Nhận dạng SNP

Các tác giả đã sử dụng dữ liệu phiên mã để xác định các SNP liên quan đến họ R4029 của S4104 trên sáu gen chính, bao gồm thụ thể mannose đại thực bào 1, UDP-glucuronosyltransferase 2B14, chitinase-1, glutathione S-transferase, Cathepsin L và Penaeidin. Tổng cộng có 127 SNP được phát hiện, trong đó có 36 SNP trong thụ thể mannose đại thực bào 1 và chỉ tám SNP trong Penaeidin.

 

Biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch khác

Các tác giả đã nghiên cứu các gen liên quan đến miễn dịch để hiểu rõ hơn về sự khác biệt trong phản ứng miễn dịch giữa các họ dễ bị nhiễm và kháng thuốc trong gan tụy. Kết quả cho thấy các peptide kháng khuẩn crustin và yếu tố kháng lipopolysaccharide có mức biểu hiện cao trong họ dễ bị nhiễm, trong khi penaeidin (PEN3) tăng cường biểu hiện trong họ kháng thuốc sau khi nhiễm EHP. Mức độ phiên mã của tế bào máu cao trong họ dễ bị nhiễm, trong khi các phiên mã mã hóa protein translocator có mức biểu hiện cao trong họ kháng thuốc.

 

Kết luận

Kết quả nghiên cứu này cho thấy hệ thống miễn dịch của tôm kháng bệnh thể hiện sự hoạt hóa rõ rệt, được chứng minh qua việc tăng cường điều hòa cathepsin L, lectin loại C, penaeidin và chitinase so với tôm dễ bị nhiễm bệnh. Đồng thời, biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa chất lạ qua cytochrome P450 cũng được nâng cao, trong khi khả năng chuyển hóa axit amin tăng cường ở tôm dễ bị nhiễm.

Những phát hiện này không chỉ làm sáng tỏ cơ sở di truyền của khả năng kháng EHP mà còn cung cấp nguồn tài nguyên quý giá cho việc phát triển các chương trình nhân giống hỗ trợ bằng dấu hiệu phân tử.

ThS. Chinh Lê

Học viện Nông nghiệp Việt Nam