[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Trong nghiên cứu này cho thấy Aeromonas hydrophila được xác nhận là tác nhân gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng nước ngọt và cho giá trị liều gây chết (LD50) là 4,8×10⁴ CFU/ml. Đồng thời kháng sinh Florfenicol có tác dụng ức chế đối với Aeromonas hydrophila và chiết xuất Punica granatum là một chất hiệp đồng tiềm năng của Florfenicol đối với vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng nước ngọt.

Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành lấy mẫu tôm thẻ chân trắng nước ngọt có trọng lượng (6,80g ± 0,05) biểu hiện teo gan tụy tại trang trại tôm ở Fengxian, Thượng Hải, Trung Quốc và được đặt trong túi vô trùng và bảo quản trên đá trong suốt quá trình đến phòng thí nghiệm.

Tiến hành đánh giá tác dụng hiệp đồng giữa thảo dược và Florfenicol được nuôi trong 34 bể kính (76cm×50cm×48cm) (10 con/bể) với 100L nước trang trại, pH là 7,5; DO 6,2mg/L; nhiệt độ 28⁰C trong 14 ngày.

Tiếp theo, 240 con tôm khỏe mạnh (0,62g ± 0,11) để thử nghiệm tác dụng bảo vệ được duy trì trong 24 bể kính (76cm×50cm×48cm) (10 con/bể) được cung cấp 100L nước trang trại được lọc có sục khí với độ pH là 7,64; DO 6,6 mg/L; nhiệt độ  ở 28⁰C trong 14 ngày. Tình trạng sức khỏe của tôm được đánh giá thông qua kiểm tra dấu hiệu bệnh tích, tốc độ tăng trưởng.

Kết quả nghiên cứu

Xác định tác nhân gây bệnh

Không tìm thấy ký sinh trùng trong mẫu tôm bị bệnh và tất cả tôm thử nghiệm cho thấy bệnh không phải do ký sinh trùng hoặc virus gây ra. Năm dòng phân lập chiếm ưu thế (được đánh số từ WS01 đến WS05) được lấy từ mẫu gan tụy của tôm bị bệnh, đã xác định là chi Bacillus và Aeromonas dựa trên phân tích gen 16S rRNA.

Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn ở tôm cho thấy chỉ có chủng phân lập (WS05) gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng, cho thấy giá trị LD50 là 4,8×10⁴ CFU/mL. Ngược lại, không có biến đổi cơ thể được ghi nhận ở tôm đối chứng. Tôm bị nhiễm bệnh có dấu hiệu teo nhũn gan tụy (Hình 1) và cùng một chủng (WS05) đã được phân lập lại từ tôm bị bệnh thực nghiệm và được xác nhận bằng nhận dạng kiểu hình và phân tử. Hơn nữa, những thay đổi mô bệnh học ở gan tụy từ tôm bị nhiễm và tôm bệnh cảm nhiễm cho thấy sự sắp xếp rối loạn của các ống gan tụy và sự xâm nhập của tế bào viêm (Hình 2).

Kết quả định danh bằng hình thái, sinh hóa kết hợp với phương pháp phân tử khẳng định chủng vi khuẩn WS05 phân lập được từ tôm thẻ chân trắng nước ngọt trong nghiên cứu là A. hydrophila.

Hình 1. Dấu hiệu chung của tôm bị ảnh hưởng trong vùng dịch bệnh.

(a) Tôm bệnh gan tụy teo nhũn (Mũi tên); (b) Tôm khỏe mạnh gan tụy bình thường (Mũi tên)

Hình 2. Những thay đổi mô bệnh học ở gan tụy bị teo của tôm bị ảnh hưởng

Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng gây bệnh

Kết quả cho thấy chủng WS05 nhạy với hầu hết các loại kháng sinh (trừ Novobiocin và Rifampicin), bao gồm: Amoxicillin, Cotrimoxazole, Cefotaxime, Doxycycline, Enrofloxacin, Florfenicol, Gentamicin, Kanamycin, Axit Nalidixic, Neomycin, Netilmicin, Oxacillin, Polymyxin B, Streptomycin, Tetracycline và Tobramycin. Đặc biệt, chủng WS05 đã thể hiện tính nhạy cao đối với Cotrimoxazole, Doxycycline, Florfenicol, Neomycin và Tetracycline, hiện đang được chấp thuận sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.

Tác dụng hiệp đồng của chiết xuất thảo dược Florfenicol

MIC của Florfenicol và chiết xuất thảo dược đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại vi khuẩn WS05 phân lập được trình bày trong Bảng 1. Kết quả chỉ ra rằng chỉ có sự kết hợp giữa Florfenicol và chiết xuất từ lựu (P. granatum) mới có tác dụng kháng khuẩn hiệp đồng đối với A. hydrophila phân lập. Khi kết hợp với 7,81 mg/mL chiết xuất từ lựu, MIC của Florfenicol chống lại WS05 phân lập đã giảm từ 0,50 xuống 0,03mg/mL. FICI cho sự kết hợp của chiết xuất Florfenicol và P. granatum được tính là 0,31.

Tuy nhiên, Florfenicol thể hiện tác dụng phụ đối với WS05 phân lập khi được kết hợp với các chiết xuất từ ngải cứu, ngải lá kim, ngũ bột tử, cây mơ, mộc thảo và cây khổ sâm. Đối với sự kết của Florfenicol với chiết xuất từ các loại thảo dược khác như: Tiểu kế, xuyên luyện tử, biển súc, hà thủ ô, cây đại hoàng, hoàng cầm, địa du,cây sài hồ, thạch xương bồ không có tác dụng. Điều này cho thấy chiết xuất P. granatum có thể được coi là một chất hiệp đồng tiềm năng của Florfenicol chống lại vi khuẩn A. hydrophila phân lập.

Bảng 1. MIC của Florfenicol và chiết xuất thảo dược đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập

MIC_S – Nồng độ ức chế tối thiểu; FFC – Florfenicol; AA – Ngải Cứu; AC – Ngải lá kim; RAT – Thạch xương bồ; CS – Tiểu kế; FT – xuyên luyện tử; GC – ngũ bột tử; PM – cây mơ; PA – biển súc; PG – Lựu ; PC – hà thủ ô; RRR – cây đại hoàng; RA – Mộc thảo; RSC – hoàng cầm; RSF – cây khổ sâm; RSA – địa du; RB – cây sài hồ.

 Hoạt động trong ống nghiệm của Florfenicol kết hợp chiết xuất P. granatum

Không quan sát thấy sự giảm mật độ vi khuẩn của chủng WS05 phân lập trong nhóm đối chứng và tác dụng đơn lẻ của Florfenicol và chiết xuất P. granatum cho thấy một hoạt động kháng khuẩn nhẹ so với nhóm đối chứng. Ngược lại, sự kết hợp giữa Florfenicol và dịch chiết P. granatum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại chủng WS05, với mật độ tế bào giảm ≥ 3,61CFU/mL sau 24 giờ điều trị so với điều trị bằng kháng sinh đơn lẻ (p < 0,05 ).

Tác dụng bảo vệ của Florfenicol kết hợp P. granatum

Tác dụng bảo vệ của Florfenicol và P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp được thể hiện trong Hình 3. Không quan sát thấy tỷ lệ chết ở tôm thử nghiệm trong các nhóm đối chứng dương và điều trị đơn lẻ bằng Florfenicol và P. granatum chỉ cho thấy tác dụng bảo vệ nhẹ so với đối chứng âm, với tỷ lệ chết tích lũy của tôm giảm 13,34% và 16,67% so với đối chứng âm.

Tuy nhiên, sự bảo vệ đã được tạo ra bởi sự kết hợp giữa chiết xuất Florfenicol và P. granatum, với tỷ lệ chết tích lũy là 36,66% (p <0,05) và 33,33% (p <0,05) thấp hơn so với điều trị đơn lẻ bằng Florfenicol và P. granatum sau cảm nhiễm với WS05 phân lập trong 7 ngày. Tiến hành giám định nhanh bằng PCR một số mẫu cho kết quả dương tính khi sử dụng cặp mồi định danh loài A. hydrophila, khẳng định vi khuẩn phân lập được sau cảm nhiễm là A. hydrophila. Những phát hiện này chỉ ra rằng sự kết hợp giữa Florfenicol và P. granatum có thể tăng cường tác dụng bảo vệ chống vi khuẩn A. hydrophila ở tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt.

Hình 3. Khả năng bảo vệ của Florfenicol và P. granatum chống lại vi khuẩn WS05 ở tôm thẻ chân trắng

Tóm lại, nghiên cứu hiện tại là nghiên cứu đầu tiên xác nhận vi khuẩn A. hydrophila là tác nhân gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt. Đồng thời kháng sinh Florfenicol có tác dụng ức chế đối với Aeromonas hydrophila và chiết xuất Punica granatum là một chất hiệp đồng tiềm năng của Florfenicol đối với vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng nước ngọt.

Ngọc Anh (Lược dịch)