[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Nghiên cứu dưới đây cho thấy cao chiết từ cây diệp hạ châu có khả năng ức chế và tiêu diệt cả 2 chủng vi khuẩn V. parahemolyticus và Vibrio sp. gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp trên tôm chân trắng ở các nồng độ từ 250 đến 1.000 mg/mL.

Sử dụng thảo dược tự nhiên để phòng và điều trị bệnh tôm là xu hướng nghiên cứu trong thời gian gần đây

Trên thế giới hiện đang có xu hướng nghiên cứu và sử dụng các hợp chất thiên nhiên nguồn gốc từ thực vật, có hoạt tính kháng khuẩn và đặc biệt là có độ an toàn cao để thay thế cho các loại kháng sinh thông dụng. Trước tình hình lạm dụng kháng sinh trong hoạt động nuôi trồng thủy sản đã gây nên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, do đó việc nghiên cứu chiết xuất các hoạt chất sinh học từ thực vật đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử dụng kháng sinh như hiện nay, không những hạn chế dịch bệnh cho vật nuôi, góp phần phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững mà còn an toàn cho người tiêu dùng cũng như thân thiện với môi trường sinh thái.

Dịch chiết từ diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) có khả năng kháng các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp trên tôm. Dịch chiết từ cây diệp hạ châu không những có khả năng kháng bệnh vi khuẩn mà chúng còn được nghiên cứu trong phòng trị bệnh do virus gây ra trên động vật thủy sản. Hoạt chất có trong cây P. amarus còn có hoạt tính mạnh chống lại virus gây bệnh Đốm trắng trên cua nước ngọt (Paratelphusa hydrodomous).

Phương pháp nghiên cứu

Cây diệp hạ châu được thu ở vùng gò đồi tại Thừa Thiên Huế. Đây là những cây trưởng thành với chiều cao trung bình 25,50 ± 4,52cm, tương ứng với khối lượng trung bình 3,21 ± 1,33 g/cây. Cây có màu sắc xanh tươi, không dập nát. Nguyên liệu được rửa bằng nước sạch và sấy khô ở 50°C để đạt độ ẩm dưới 10%. Nguyên liệu khô của cây diệp hạ châu sau đó được xay mịn và cho qua rây có kích thước d = 1mm. Bột nguyên liệu được tiến hành bảo quản trong túi polyethylene đặt trong hộp nhựa kín, lưu trữ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng và độ ẩm để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Phương pháp chiết xuất bột cây diệp hạ châu (100g) được ngâm trong ethanol 70% với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:5 trong 48 giờ có khuấy đều. Dịch chiết lần 1 được thu nhận thông qua hệ thống lọc chân không (Rocker 300-LF31) trên giấy Whatman số 4 (code: 1004042, kích thước lỗ giấy 20–25 µm). Phần bã nguyên liệu sau đó tiếp tục ngâm trong ethanol 40% (1:5) trong 48 giờ, lọc lấy dịch chiết lần 2. Dịch chiết thu được của hai lần trộn lẫn lại với nhau và được cô thành cao ở 60o C trên hệ thống cô quay chân không Heidolph của Đức. Cao được bảo quản trong tối ở nhiệt độ < 10o C và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và Vibrio sp. được xác định là tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm chân trắng. Vi khuẩn được phân lập, định danh và lưu giữ ở nhiệt độ –80°C tại Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế. Mật độ vi khuẩn sẽ được điều chỉnh về 106 CFU/mL để thử kháng sinh đồ và MIC.

Kết quả nghiên cứu

 Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết cây diệp hạ châu

Kết quả thử nghiệm cho thấy dịch chiết từ cây diệp hạ châu có khả năng kháng cả 2 chủng vi khuẩn V. parahaemolitycus và Vibrio sp. gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng nuôi.

Dịch chiết từ cây diệp hạ châu có khả năng kháng cả 2 chủng vi khuẩn được thử nghiệm và mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ của dịch chiết sử dụng, có nghĩa là nồng độ dịch chiết càng cao thì đường kính vòng kháng khuẩn càng lớn.

Hình 1. Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết cây diệp hạ châu

A1, A2: Vi khuẩn V. parahaemolyticus; B1, B2: Vi khuẩn Vibrio sp.; 1, 2, 3, 4: các nồng độ dịch chiết 250, 500, 750, 1.000 mg/mL; Dx: doxycylin; Am: ampicilin; ĐC(–): Đối chứng âm – nước cất vô trùng

Dịch chiết có khả năng kháng khuẩn thấp nhất ở nồng độ 250 mg/mL đối với V. parahaemolyticus và Vibrio sp. đạt lần lượt là 16,6 và 17,6 mm, thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với doxycylin (30 µg) đạt lần lượt tương ứng là 19,8 và 24,8 mm. Trong khi đó, ampicillin (10 µg) không có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm (Hình 1). Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết với 2 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và Vibrio sp. ở nồng độ 750 và 1.000 mg/mL đạt lần lượt tương ứng là 20,6; 21,4 mm và 23,2; 23,6 mm và không khác biệt có nghĩa thống kê. Trong đó, chỉ đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết trên chủng V. parahaemolyticus ở nồng độ 1.000 mg/mL (21,4 mm) là cao hơn so với kháng sinh doxycylin (30 µg) đạt 19,8 mm (p< 0,05). Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hoàn toàn có thể thay thế cho kháng sinh trong điều trị bệnh do Vibrio spp. gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng.

Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây diệp hạ châu theo thời gian

Kết quả cho thấy khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh ở mật độ 106 CFU/mL của dịch chiết đều giảm dần theo thời gian. Cụ thể đối với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus ở nồng độ 250 mg/mL và 500 mg/mL đã nhận thấy sự phát triển trở lại của vi khuẩn ở 72 giờ (Hình 2A). Trong khi đó, ở chủng vi khuẩn Vibrio sp., đường kính vòng kháng khuẩn cũng giảm dần theo thời gian, nhưng vi khuẩn bắt đầu phát triển trở lại ở tất cả các nồng độ dịch chiết ở 96 giờ (Hình 2B). Lúc này, các nghiệm thức đều không còn khả năng kháng khuẩn đối với ở tất cả các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Điều này có thể là do vi khuẩn đã dần thích nghi với môi trường thử nghiệm và cũng có thể là do hàm lượng và hoạt tính của các hoạt chất có trong dịch chiết đã giảm theo thời gian.

Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cây diệp hạ châu theo thời gian đối với từng loại vi khuẩn (A) V. parahaemolyticus; (B) Vibrio sp

Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết đối với chủng vi khuẩn V. parahemolyticus đạt 125 mg/mL, trong khi đó giá trị MIC đối với chủng Vibrio sp. khá thấp đạt 62,5 mg/mL. Điều này cho thấy khả năng ức chế của dịch chiết đối với vi khuẩn Vibrio sp. là tốt hơn so với vi khuẩn V. parahemolyticus.

Như vậy, kết quả nghiên cứu này cho thấy dịch chiết từ cây diệp hạ châu có khả năng ức chế và tiêu diệt các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và Vibrio sp. gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng, được thể hiện tỷ lệ MBC/MIC đều bằng 4.

Kết luận

Cao chiết từ cây diệp hạ châu có khả năng kháng cả 2 chủng vi khuẩn V. parahemolyticus và Vibrio sp. gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp trên tôm chân trắng ở các nồng độ từ 250 đến 1.000 mg/mL. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết giảm dần theo thời gian thử nghiệm, trong đó chủng vi khuẩn V. parahemolyticus đã phát triển trở lại ở 72 giờ ở nồng độ từ 250–500 mg/mL, đối với chủng vi khuẩn Vibrio sp. phát triển trở lại sau 96 giờ ở tất cả các nồng độ thử nghiệm. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với chủng V. parahemolyticus là 125 mg/mL và chủng Vibrio sp. là 62,5 mg/mL; tỷ lệ MBC/MIC của cả 2 chủng đều bằng 4, chứng tỏ dịch chiết có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn V. parahemolyticus và Vibrio sp.

Hảo Mai (Biên tập)