[Người Nuôi Tôm] – Bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) được coi là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với ngành nuôi tôm và có thể gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế.

Nghiên cứu cho rằng, Coumarin 3004 là chất điều trị tuyệt vời có khả năng chống lại sự lây lan của WSSV trong nuôi tôm

 

Nguyên nhân gây ra bệnh đốm trắng là virus hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) (Wang và cộng sự, 1995), thuộc thành viên duy nhất của chi Whispovirus và họ Nimaviridae. Sự lây nhiễm virus thường gây ra 100% tỷ lệ chết trong một trang trại nuôi tôm chỉ trong vòng 2 – 10 ngày phát hiện. Sự bùng phát bệnh đốm trắng trong nhiều năm trở lại đây trên tôm nuôi đã thúc đẩy nhiều nỗ lực khoa học đáng kể nhằm thiết lập các cơ chế tiềm ẩn gây ra bệnh và xác định các phương pháp phòng ngừa và giảm thiểu thiệt hại. Bất chấp một số nghiên cứu trong việc thiết lập các phương pháp bảo vệ, bao gồm cả việc tiếp xúc trước với mầm bệnh, kiểm soát môi trường và sử dụng miễn dịch bẩm sinh, bệnh đốm trắng vẫn còn tỷ lệ chết cao đối với tôm. Do đó, cần phát triển một phương pháp điều trị hiệu quả để kiểm soát sự lây nhiễm WSSV nhằm giảm thiểu thiệt hại kinh tế của ngành nuôi tôm.

Coumarin là một hữu cơ thơm hợp chất hóa học trong benzopyrone lớp hóa chất, mặc dù nó cũng có thể được xem như là một lớp con của lacton. Nó là một chất tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và là chất kết tinh không màu ở trạng thái tiêu chuẩn. Coumarin có nguồn gốc từ các bộ phận khác nhau của một số thảo dược. Hoạt tính kháng virus của coumarin và các dẫn xuất của nó đã được chứng minh chống lại nhiều loại virus như virus cúm, HIV, Enterovirus 71 (EV71), coxsackievirus A16 (CVA16), virus sốt xuất huyết và virus chikungunya.

Coumarin có khả năng nhắm mục tiêu vào các con đường tế bào khác nhau của virus, ức chế sự phát triển và nhân rộng của chúng. Trong nuôi trồng thủy sản, các nhà nghiên cứu đã tổng hợp một loạt các dẫn xuất coumarin để ứng dụng trong việc ức chế virus gây bệnh trong mùa xuân của virus cá chép (spring viremia of carp virus – SVCV) nhân lên trong ống nghiệm và in vivo. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng sự sao chép của WSSV đã bị ngăn chặn hơn 90% khi có mặt các dẫn xuất coumarin (10 mg/ L C3007 và 20 mg/ L N2905) trong 72 giờ nhiễm. Do đó, trong nghiên cứu của Đại học Ninh Ba (Trung Quốc), một dẫn xuất của Coumarin là 2-amino-4- (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) -5-oxo-4H, 5H-pyrano [3,2-c] chromene-3 – carbonitril (Coumarin 3004) đã được lựa chọn để thử nghiệm ức chế sự lây nhiễm WSSV và cải thiện tỷ lệ sống sót của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vanamei bị nhiễm WSSV. 

Thí nghiệm đầu tiên được thực hiện với đánh giá in vivo về sự an toàn của Coumarin 3004. Ấu trùng post-larvae của tôm thẻ chân trắng chiều dài trung bình 0,52 cm và trọng lượng cơ thể trung bình 4,2 mg được cung cấp bởi Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản Chiết Giang (Ôn Châu, Trung Quốc). Ấu trùng được thả trong ao và cho ăn bốn lần một ngày bằng thức ăn viên công nghiệp. Ấu trùng postlarvae được ngâm trong các nồng độ khác nhau của Coumarin 3004 (10, 20, 30 hoặc 40 mg/ L) hoặc 0,08% DMSO với mật độ 10 PL/ giếng trong 6 tiếng. Ấu trùng được kiểm tra tỷ lệ chết trong thí nghiệm này.

Kết quả cho thấy ở nồng độ 20–40 mg/L, Coumarin 3004 không bị hòa tan trong nước. Tỷ lệ sống của ấu trùng là 100% ở 10 mg/ L trong 3 ngày. Do đó, 10 mg/ L được chọn làm nồng độ cho thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm thứ hai là thử nghiệm in vivo về sự ức chế WSSV. Ấu trùng PL được ngâm trong các giếng có chứa Coumarin 3004 (0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5 hoặc 10 mg/ L) hoặc 0,02% DMSO ở 28°C. Mỗi giếng được bổ sung WSSV với mức 1,6 × 105 copies/μL. Tỷ lệ sống được ghi lại trong khoảng thời gian 12 giờ. Sau 72 giờ, hoạt tính kháng virus của Coumarin 3004 đối với sự nhân lên của WSSV ở ấu trùng tôm được phân tích bằng qPCR. Kết quả cho thấy Coumarin 3004 ức chế đáng kể sự nhân lên của WSSV ở ấu trùng với đáp ứng kháng virus tối đa > 95%; hơn nữa, Coumarin có tác dụng bảo vệ phụ thuộc vào liều lượng đối với hậu ấu trùng nhiễm WSSV. Tỷ lệ sống của ấu trùng nhiễm WSSV là 0% ở 72 giờ; ngược lại, ở nhóm được điều trị bằng Coumarin 3004, tỷ lệ chết của ấu trùng nhiễm WSSV chỉ là 30%.

Thí nghiệm thứ ba đánh giá tác dụng dược lý của Coumarin 3004 đối với WSSV bằng ba cách. Thứ nhất, ấu trùng PL được ngâm trước với Coumarin 3004 (10 mg/ L) trong 1, 4 hoặc 8 giờ, rửa hai lần bằng nước và ngâm trong dung dịch pha loãng có chứa WSSV. Thứ hai, ấu trùng được ngâm trong dung dịch pha loãng WSSV trong 24 giờ hoặc 48 giờ ở 28°C. Sau đó, virus được loại bỏ và ấu trùng được rửa hai lần bằng nước trước khi bổ sung Coumarin 3004 (10 mg/ L). Thứ ba, ấu trùng được đồng xử lý với chất pha loãng WSSV và 10 mg/ L Coumarin 3004 ở 28°C. Kết quả kiểm tra hiệu quả của Coumarin 3004 trên ấu trùng nhiễm WSSV cho thấy Coumarin 3004 ngăn chặn hiệu quả sự nhân lên của virus sau khi nhiễm WSSV của hậu ấu trùng trong 24 giờ, nhưng không có ở 48 giờ. Hơn nữa, điều này đã được chứng thực trong thí nghiệm về tỷ lệ tử vong, trong đó Coumarin 3004 có hiệu quả hơn trong việc giảm tỷ lệ tử vong của ấu trùng bị nhiễm WSSV trong 24 giờ so với 48 giờ.

Thí nghiệm thứ tư đánh giá ảnh hưởng của Coumarin 3004 đối với khả năng gây bệnh của WSSV. WSSV (nồng độ 8 × 107 copies/ μL) và Coumarin 3004 (10 mg/ L) được trộn với nước trong 1, 2 hoặc 4 giờ. Tiếp theo, dung dịch được pha loãng 50 lần trong nước, tạo ra 1,6 × 105 copies/ μL WSSV và 0,2 mg/ L Coumarin 3004, và được ngâm với ấu trùng PL. Mỗi lần điều trị được thực hiện trong ba lần và phân tích bằng phương pháp qPCR. Coumarin 3004 cho thấy tác dụng ức chế vượt trội khi virus được ủ sẵn phân tử trước khi cấy. Điều này cho thấy Coumarin 3004 có thể tác động trực tiếp lên WSSV. Coumarin 3004 làm suy yếu khả năng lây nhiễm WSSV khi ủ bệnh trước với WSSV lâu hơn, làm giảm tỷ lệ chết của ấu trùng.

Thí nghiệm thứ năm nhằm kiểm tra tính ổn định của Coumarin 3004 trong môi trường nuôi trồng thủy sản. Coumarin 3004 (nồng độ 10 mg/ L) được thêm vào nước biển và duy trì trong mẫu nước từ 0–4 ngày ở 28°C. Vào ngày cuối cùng, ấu trùng PL được ngâm trong WSSV và nước được xử lý Coumarin 3004 (ba lần lặp lại). Sau đó, một xét nghiệm qPCR đã được thực hiện để phát hiện các tải WSSV. Kết quả ghi nhận được không có thay đổi đáng kể về hiệu quả của Coumarin 3004 trong hai ngày trong nước. Tuy nhiên, tác dụng của Coumarin 3004 giảm dần theo thời gian ở trong nước. Cần phải chọn một khoảng thời gian thích hợp cho việc áp dụng Coumarin 3004 trong thực tế. Các kết quả trên phù hợp với các thí nghiệm về tỷ lệ chết. Cụ thể, trong nhóm xử lý WSSV Coumarin 3004-0 d, WSSV Coumarin 3004-1 d, WSSV Coumarin 3004-2 d, WSSV Coumarin 3004-3 d và WSSV Coumarin 3004-4 d, thời gian ấu trùng sống lên đến lần lượt là 120 giờ, 120 giờ, 108 h, 108 h và 84 h.

Thí nghiệm cuối cùng là đánh giá tác dụng kháng vi rút của Coumarin 3004 ở tôm giống. Tôm giống (chiều dài 4,15 và trọng lượng 0,35 g) được mua từ trang trại địa phương. Tôm được thả trong bể nuôi 100 L ở 28°C và cho ăn ba lần một ngày với thức ăn viên công nghiệp. Tôm giống được ngâm trước với WSSV (8 × 105 copies/ μL) trong 12 giờ và được đưa vào bể nuôi (1 L nước) có chứa Coumarin 3004 (10 mg/ L, không có độc tính) hoặc 0,02% DMSO. Sau 60 giờ, mang và hồng cầu được thu thập từ Ten tôm con. Haemolymph được thu thập bằng một ống tiêm 1 mL chứa một thể tích tương đương dung dịch chống đông máu (26 mM axit xitric, 140 mM NaCl, 200 mM glucoza, 10 mM EDTA, 30 mM trinatri citrat, pH 4,6) và được ly tâm ở 4°C, 1000 × g trong 5 phút để thu thập huyết cầu. Kết quả cho thấy mức độ virus trong mang và huyết cầu ở nhóm thuốc thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng, với sự giảm số lượng virus khoảng 90% ở cả hai nhóm, góp phần cải thiện tỷ lệ sống của tôm nhiễm WSSV. Trong mô hình thay đổi thuốc liên tục, tỷ lệ chết (132 giờ) của tôm nhiễm WSSV là 100% và 55% khi có và không có Coumarin 3004. Ngoài ra, bốn peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides – AMP) của tôm đã được phát hiện. Sự biểu hiện của yếu tố anti-lipopolysaccharide 1 (ALF1), lysozyme 1 (LYZ1), crushtin 1 (CRU1) và penaeidin 4 (PEN4) đều giảm ở mang, trong khi sự biểu hiện của chúng được phát hiện trong huyết cầu. Đáng chú ý là các biểu hiện của AMP đều được tăng cường bởi Coumarin 3004, do đó tăng cường tác dụng kháng virus.

Với việc Coumarin 3004 đã chặn việc ngăn chặn WSSV trong mô hình thử nghiệm, Coumarin 3004 là một chất điều trị tuyệt vời có khả năng chống lại sự lây lan của WSSV trong nuôi tôm. 

Chinh Lê

Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam