[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Việc PCR bị lạm dụng rộng rãi và thiếu hiểu biết có thể gây ra các vấn đề nghiêm trọng về dương tính giả, âm tính giả hoặc thậm chí là các phản ứng hỗn hợp khiến người dùng hiểu sai.

Phương pháp PRC là một công cụ chứ không phải là một giải pháp

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một công cụ phân tử rất mạnh cho phép phát hiện hàm lượng rất thấp axit deoxyribonucleic hoặc DNA (mã di truyền hoặc vật liệu di truyền của sinh vật). Cốt lõi của phương pháp này khuếch đại lượng DNA hiện có. PCR có độ nhạy và đặc hiệu cao. PCR có thể được sử dụng để xác định xem có mầm bệnh hay không, không xác định được có bao nhiêu mầm bệnh. Công nghệ PCR đã cách mạng hóa sự hiểu biết của chúng ta về thế giới xung quanh.

Như với hầu hết các phản ứng hóa học, các điều kiện mà xét nghiệm PCR diễn ra là chính xác và ngay cả những thay đổi nhỏ cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả. Kiểm soát không đúng cách, nhiễm bẩn mẫu và thuốc thử, không tuân thủ các yêu cầu về chu kỳ nhiệt, v.v. đều có thể dẫn đến kết quả xét nghiệm có giá trị đáng ngờ.  Đây là một lý do tại sao các phòng thí nghiệm tiến hành các thử nghiệm này thường xuyên nên được bên thứ ba kiểm tra để xác minh rằng họ thực sự đang đo lường chính xác và nhất quán, vì rất dễ xảy ra sai sót.

Sai lầm số 1: Kết quả tích cực luôn có thật

Các mồi được xây dựng đúng cách là dành riêng cho một sinh vật nhất định.  Mặc dù người ta cho rằng trình tự mồi là duy nhất, nhưng nếu nó không phải là duy nhất thì mồi có thể phản ứng chéo với DNA từ các sinh vật khác. Mọi nỗ lực được thực hiện để giảm thiểu điều này bằng cách tập trung vào các gen được cho là duy nhất. Đối với một số tác nhân gây bệnh, chẳng hạn như tác nhân gây bệnh là virus gây Hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mô (IHHNV), điều này không đơn giản. Tôm được biết là kết hợp các đoạn DNA của virus vào bộ gen của chúng (tất cả vật liệu di truyền).

Trình tự mồi phải được định hướng chống lại các trình tự DNA phù hợp với sự lây nhiễm và không kết hợp với bộ gen của vật chủ. Bản chất của công nghệ PCR là có thể thiết kế các trình tự mồi không tìm thấy ở bất kỳ sinh vật nào khác. Điều đó nói rằng, bóng ma của phản ứng chéo dẫn đến dữ liệu sai lệch là quá thực tế. Mặc dù các biện pháp kiểm soát thích hợp được thực hiện để đảm bảo rằng điều này không xảy ra, nhưng điều đó không có nghĩa là nó không thể xảy ra.  Trong trường hợp của IHHNV, nếu chúng ta đang tìm kiếm những vật chủ mang mầm bệnh chứa virus có thể lây lan, thì chúng ta phải đảm bảo rằng trình tự mồi phù hợp với việc tìm ra vius chứ không phải thể vùi không lây nhiễm.

Sai lầm số 2: Sàng lọc quần thể bằng PCR là một công cụ thống kê rất phù hợp để xác định sự vắng mặt của DNA phản ứng mồi

Công nghệ này được sử dụng rộng rãi để thử nghiệm trên các quần thể lớn. Nhưng khi được sử dụng một mình, nó có thể dẫn đến âm tính giả.  Phương pháp này phù hợp nhất để xét nghiệm các cá thể nhằm xác định tình trạng vật chủ mang mầm bệnh và khả năng xuất hiện các sinh vật cụ thể có thể dẫn đến bệnh cấp tính.

Một ví dụ điển hình của việc này là kiểm tra sự hiện diện của virus gây ra Hội chứng Đốm trắng (WSSV). Con đường lây truyền chủ yếu của bệnh này là thông qua vật chủ mang mầm bệnh. Tôm bố mẹ mang virus và truyền sang hậu ấu trùng tôm (PL), từ đó tôm sẽ mang virus vào môi trường sản xuất. Đối với hầu hết các mầm bệnh có độc lực cao, không có khả năng chịu đựng. Nếu chúng có mặt và các điều kiện phù hợp với việc cho phép virus sinh sôi nảy nở, thì chỉ cần một số lượng rất nhỏ (một) vật chủ mang mầm bệnh.

Việc lấy mẫu phải được thực hiện ngẫu nhiên và công nghệ phải chính xác 100%.  Nhưng trong các quần thể lớn, mức độ chính xác cao nhất là 98%, nghĩa là 2% số lượng vẫn có thể mang mầm bệnh.  Trong số một triệu con tôm PL, 20.000 con vẫn có thể mang mầm bệnh và xét nghiệm PCR có thể cho bạn kết quả âm tính.

Nhiều công ty kiểm tra tôm bố mẹ và PL thường xuyên để tìm một số mầm bệnh, điển hình là những mầm bệnh mà Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) quy định. Do chi phí chạy thử nghiệm PCR và thiếu sự giám sát theo quy định nên thường chỉ một mẫu nhỏ động vật được thử nghiệm.  Kết quả cuối cùng là mầm bệnh thường xuyên xâm nhập vào quần thể nhạy cảm.  Việc sử dụng PCR không thể và không bảo vệ được động vật.

Sai lầm số 3: PCR phù hợp để kiểm tra sự hiện diện của bất kỳ mầm bệnh giả định nào

Không phải tất cả mầm bệnh đều có mặt trong tất cả các mô. Nếu mức độ nhiễm trùng rất thấp, thì điều quan trọng là phải lấy mẫu những mô được biết là mục tiêu của mầm bệnh. Hơn nữa, đối với một số tác nhân gây bệnh, chỉ lấy một mẫu là không đủ. Sử dụng WSSV làm ví dụ một lần nữa, loại virus này nhân lên rất kém ở nhiệt độ nước trên khoảng 31^oC. Phần lớn, trừ khi có các yếu tố gây căng thẳng nghiêm trọng và có bằng chứng rõ ràng về nhiễm trùng, tải lượng virus ở động vật được nuôi trong nước ấm hơn là quá thấp để có thể phát hiện được thông qua PCR.

Ngay cả khi tập trung vào các mô mục tiêu, virus có thể không hoạt động và việc tìm ra nó giống như mò kim đáy bể. Động vật được thử nghiệm cần phải được giữ trong các điều kiện sẽ buộc virus biểu hiện.  Giảm dần nhiệt độ nước xuống khoảng giữa 20^oC và giữ động vật trong vài ngày là cách duy nhất để chắc chắn rằng virus không có trong quần thể khi xét nghiệm bằng PCR. Nếu điều này không được thực hiện, thì người ta không thể khẳng định rằng quần thể quan tâm không có WSSV. Trên thực tế, có nhiều trường hợp động vật được tuyên bố là không nhiễm WSSV khi virus này không hoạt động và dẫn đến bùng phát dịch bệnh lớn.

 Sai lầm số 4: Có thể sử dụng PCR để xác định một quần thể là SPF

Khái niệm không có mầm bệnh cụ thể (SPF) là rất quan trọng. Nếu người ta hiểu định nghĩa theo nghĩa đen, điều đó có nghĩa là một mầm bệnh nhất định không có trong đàn vật nuôi được thử nghiệm.

Bản thân PCR không thể cho phép người ta tuyên bố một quần thể động vật là SPF. SPF là một quá trình chứ không phải là kết quả của việc thử nghiệm có giới hạn đối với một nhóm động vật. Cách duy nhất người ta có thể chắc chắn rằng một quần thể là SPF, không cần kiểm tra từng con riêng lẻ (con bố mẹ) trong các điều kiện thích hợp là thông qua lịch sử của chúng. Đây không phải là một thực tế phổ biến và nhiều nông dân thấy mình đang ở giữa tình trạng chết hàng loạt do hậu quả trực tiếp của PL mang virus.

Việc sử dụng các trung tâm nhân giống hạt nhân (NBC) được xây dựng phù hợp cùng với sàng lọc PCR và lịch sử động vật trên thực tế là cách tốt nhất để đảm bảo rằng một quần thể thực sự là SPF. Động vật cần được thả nuôi theo cách ngăn ngừa ô nhiễm từ thức ăn sống, từ động vật được sàng lọc không đầy đủ, từ cơ sở thả nuôi được thiết kế kém và các yếu tố cần cân nhắc khác. NBC không bao giờ được mở – động vật có thể rời khỏi cơ sở, nhưng chúng không thể vào lại.

Quan điểm

Xét nghiệm PCR là một công cụ có giá trị khi được sử dụng đúng cách.  Một kết quả tiêu cực đối với một mẫu phụ của một quần thể lớn kết hợp với việc không theo dõi và không sử dụng NBC được thiết kế phù hợp có thể dẫn đến một thảm họa. Điều này không có nghĩa là PCR không có giá trị, nhưng việc chỉ dựa vào nó không phù hợp với mức độ an toàn sinh học đầy đủ và tính bền vững thực sự.

Theo Tephen G. Newman, Ph.D – President and CEO Aquaintech Inc.

Hiểu Lam (Biên dịch)