[Người Nuôi Tôm] – Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) chiếm hơn 75% sản lượng nuôi tôm toàn cầu, nhưng mở rộng nuôi làm gia tăng dịch bệnh, đặc biệt là Vibriosis. Giải pháp bền vững là chọn giống kháng bệnh thay vì lạm dụng kháng sinh. Nghiên cứu mới của Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc lần đầu phân tích vùng promoter gen LvLTLC1, phát hiện SNP liên quan đến tính trạng kháng nhiều loài Vibrio, mở ra hướng chọn giống tăng sức đề kháng.

 

Vật liệu và phương pháp

– Tôm thí nghiệm và cảm nhiễm: Tổng cộng 200 cá thể tôm thẻ chân trắng (10–15 g) được thu từ 4 trại nuôi tại Trạm Giang (Quảng Đông, Trung Quốc) và nuôi tạm trong bể 800 L. Ngoài ra, 308 cá thể từ 4 trại ở Mao Minh được thu làm nhóm xác nhận (VAL). Mẫu gan tụy (0,1 g) được lấy để định lượng tải lượng Vibrio (VLs); phần còn lại của gan tụy và cơ được lưu trữ ở –80°C cho các phân tích khác.

– Xác định tải lượng Vibrio: Mẫu gan tụy được đồng nhất, pha loãng, sau đó cấy trên môi trường TCBS để tính số khuẩn lạc (CFU/g). Dựa trên VLs, 20 cá thể kháng Vibrio (VR, 10% thấp nhất) và 20 cá thể mẫn cảm (VS, 10% cao nhất) được chọn để phân tích.

– Real-time PCR và phân tích dữ liệu: RNA tổng số từ gan tụy được tách, tổng hợp cDNA, và định lượng biểu hiện gen LvLTLC1 bằng RT-qPCR (β-actin làm gen tham chiếu). Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA LvLTLC1 và VLs được phân tích bằng hệ số tương quan Pearson (SPSS 27.0).

– Khuếch đại PCR và giải trình tự: DNA của 20 cá thể mỗi nhóm VR và VS được tách chiết, khuếch đại vùng promoter của LvLTLC1, sản phẩm PCR được điện di, giải trình tự và xác định SNP bằng phần mềm SnapGene 6.

– Phân tích SNP và haplotype: Các kiểu gen SNP được so sánh giữa hai nhóm. SNP có sự khác biệt đáng kể (P < 0,05) được chọn để phân tích mối liên hệ với tính trạng kháng Vibrio toàn diện (PVR). Liên kết mất cân bằng (LD) được phân tích bằng Haploview.

– Xác nhận trên nhóm VAL: 308 cá thể trong nhóm VAL được genotyping bằng PCR và giải trình tự để xác nhận mối liên quan giữa SNP/haplotype và PVR. Các tham số đa dạng di truyền (Ne, Ho, He, tần số alen, PIC) được tính bằng Popgene 32. Kiểm định Hardy–Weinberg được thực hiện bằng SHEsis PLUS.

– Dự đoán vị trí gắn của yếu tố phiên mã (TFs): Các phần tử điều hòa cốt lõi trong vùng promoter được phân tích bằng Patch System và cơ sở dữ liệu JASPAR. Các TF có điểm số dự đoán >85% được coi là đáng tin cậy để đánh giá vai trò tiềm năng trong điều hòa gen.

 

Kết quả về biểu hiện tính trạng PVR và mức độ gen LvLTLC1 giữa nhóm VR và VS

Dựa trên VLs ở gan tụy, 20 cá thể kháng Vibrio (VR, VLs < 10⁴ CFU/g) và 20 cá thể mẫn cảm (VS, VLs > 10⁷ CFU/g) đã được chọn lọc. Kết quả cho thấy mức biểu hiện gen LvLTLC1 ở gan tụy nhóm VR cao hơn rõ rệt so với nhóm VS (P < 0,05). Hơn nữa, biểu hiện LvLTLC1 có mối tương quan âm với VLs, khẳng định vai trò quan trọng của gen này trong cơ chế kháng Vibrio.

Hình 1. VL trong nhóm VS và VR. (A) Thống kê VL của nhóm VR và VS. (B) VL của các cá nhân điển hình trong nhóm VR và VS.

Hình 2. Biểu hiện mRNA của gen LVLTLC1 ở nhóm VS và nhóm VR và mối tương quan của chúng với VL. (A) Biểu hiện gen LvLTLC1 ở nhóm VS và nhóm VR. (B) Phân tích mối tương quan giữa biểu hiện gen và VL

 

Phát hiện SNP trong vùng promoter của LvLTLC1 và mối liên hệ với tính trạng PVR

So sánh với trình tự tham chiếu LvLTLC1, 24 vị trí SNP được xác định khác biệt giữa nhóm VR và VS, tất cả nằm trong 500 bp vùng promoter – nơi tập trung các yếu tố phiên mã tiềm năng. Trong số đó, chỉ SNP8 (g.–256 A/G) và SNP16 (g.–116 A/G) có sự khác biệt kiểu gen có ý nghĩa thống kê. Đáng chú ý, kiểu gen đồng hợp GG tại SNP8 chỉ xuất hiện ở ba cá thể VR và không hiện diện trong nhóm VS. Ngược lại, SNP16 tuy khác biệt giữa hai nhóm nhưng không có kiểu gen liên quan đến PVR; kiểu gen AG của SNP16 lại gắn với tính trạng mẫn cảm, xuất hiện ở 91,6% cá thể VS. Do đó, SNP16 không phải là chỉ thị tin cậy cho tính trạng PVR, mà có khả năng liên quan đến sự mẫn cảm. Trong toàn bộ các SNP, SNP8 có giá trị P thấp nhất, cho thấy kiểu gen đồng hợp GG tại SNP8 là ứng viên tiềm năng cho chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng kháng Vibrio toàn diện (PVR) ở tôm thẻ.

Hình 3. Bốn vị trí SNP trong vùng khởi động có kiểu gen khác nhau ở nhóm VR và VS.

 

Haplotypes trong vùng promoter của LvLTLC1 và phân tích tương quan với tính trạng PVR

Phân tích LD cho thấy SNP9 và SNP10 có mức độ liên kết cao, do đó các haplotype của hai SNP này được đưa vào phân tích tương quan với tính trạng PVR. Kết quả ghi nhận 5 cá thể mang haplotype TG, trong đó 4 cá thể (80%) thuộc nhóm VR và chỉ 1 cá thể (20%) thuộc nhóm VS. Điều này gợi ý haplotype TG có liên quan đến khả năng kháng Vibrio, và có thể đóng vai trò là một chỉ thị phân tử tiềm năng cho tính trạng PVR ở tôm thẻ.

 

Tham số đa dạng di truyền dựa trên SNP8 trong nhóm VAL

Nhóm VAL gồm 308 cá thể tôm được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền dựa trên SNP8, vốn thể hiện mối liên hệ chặt chẽ nhất với tính trạng PVR. Kết quả genotyping được dùng để tính tần số alen và các tham số di truyền. Kiểm định Chi-square cho thấy SNP8 tuân theo cân bằng Hardy–Weinberg (HWE). Đồng thời, SNP8 có mức đa hình thấp (PIC < 0,25), phản ánh sự biến đổi di truyền tại vị trí này hiếm gặp, phù hợp với quan sát rằng tính trạng PVR vốn hiếm trong quần thể tôm. Những kết quả này củng cố cơ sở di truyền của SNP8, cho thấy đây là một chỉ thị phân tử tiềm năng cho tính trạng PVR.

Hình 4. Kiểu gen của 24 locus SNP trong vùng khởi động của gen LvLTLC1. Màu đỏ biểu thị LD mạnh và ô vuông đánh dấu các SNP LD.

 

Xác minh mối liên hệ giữa kiểu gen/haplotype ứng viên và tính trạng PVR trong nhóm VAL

Trong nhóm VAL gồm 308 cá thể, tính trạng PVR được phân cấp thành 10 bậc dựa trên tải lượng Vibrio (VLs), dao động từ 10³ đến 1,65 × 10⁷ CFU/g với phân bố chuẩn, xác nhận bằng Q-Q test. Điều này cho thấy tính trạng PVR phân hóa đa dạng, từ kháng mạnh đến mẫn cảm, nhưng các trường hợp cực đoan ít gặp. Phân tích kiểu gen tại SNP8 cho thấy ba kiểu gen có sự khác biệt VLs có ý nghĩa (P < 0,01). Cá thể mang allele G (AG hoặc GG) có VLs thấp hơn đáng kể so với AA, và VLs giảm khi số lượng allele G tăng. Đặc biệt, kiểu gen GG gắn với mức VLs rất thấp (<10⁴ CFU/g), thể hiện tính kháng cao. Đối với SNP9 và SNP10, phân tích LD trong nhóm VAL cho thấy mất cân bằng liên kết mạnh (D’ = 0,922). Haplotype TG có VLs thấp hơn rõ rệt so với các haplotype khác, đặc biệt khi kết hợp TT/GG, hai cá thể mang kiểu gen này được xếp vào nhóm PVR với VLs <10⁴ CFU/g. Kiểu gen TT/AG cũng cho VLs thấp hơn phần lớn haplotype khác, mặc dù cao hơn TT/GG. Kết quả cho thấy SNP10 ở trạng thái đồng hợp có vai trò quan trọng trong hiệu ứng kết hợp SNP9–SNP10. Tóm lại, SNP8 (đặc biệt kiểu gen GG) và haplotype TG (SNP9–SNP10) là các chỉ thị phân tử tiềm năng liên quan đến tính trạng kháng Vibrio toàn diện (PVR) ở tôm thẻ.

Hình 5. Phân bố VL trong nhóm VAL. (A) Biểu đồ tần suất VL. Nhiễm trùng tăng khi màu đậm hơn. (B) Biểu đồ Q-Q cho kiểm định phân phối chuẩn.

Hình 6. Tương quan giữa kiểu gen, kiểu gen đơn bội và VL trong nhóm VAL. (A) VL và phân bố của các cá thể có kiểu gen khác nhau trong SNP8 (B) VL và phân bố của các cá thể có kiểu gen đơn bội khác nhau trong SNP9 và SNP10.

Hình 7. Tổ hợp kiểu gen của haplotype TG của SNP9 và SNP10 có liên quan đến VL. Các số trong ngoặc đơn theo sau tổ hợp kiểu gen biểu thị kích thước cá thể.

 

Biến dị SNP làm thay đổi mô hình gắn kết của các yếu tố phiên mã (TFs)

Phân tích dự đoán bằng JASPAR (điểm tương đối >0,85) cho thấy các biến dị SNP trong vùng promoter LvLTLC1 dẫn đến thay đổi số lượng và loại TF có khả năng gắn vào motif (TFBSs). Ở SNP8 (g.–256), alen A tạo ra bốn TF dự đoán thuộc ba họ (FAEOB II, MYB62, STAT3 và MOT3), trong khi alen G lại sinh ba TF hoàn toàn khác (STAT3, Fox A-b, tbx-37). Tại SNP9 (g.–249), alen T tạo ra bốn TF thuộc ba họ, còn alen G sinh năm TF thuộc hai họ, trong đó có TF DOF5.7 với vị trí gắn mở rộng. Ở SNP10 (g.–235), alen A sinh bốn TF thuộc hai họ, nhưng alen G chỉ còn hai TF. Đáng chú ý, biến đổi A→G ở SNP10 cũng thay đổi trình tự motif nhận diện TF STAT3. Kết quả này cho thấy các SNP trong vùng promoter có thể làm biến đổi mô hình gắn TF, từ đó ảnh hưởng đến điều hòa biểu hiện gen LvLTLC1 và tính trạng PVR ở tôm thẻ.

Hình 8. Phân tích dự đoán các yếu tố phiên mã. (A) Nhiều họ yếu tố phiên mã liên kết với các mô típ chứa SNP8, SNP9 và SNP10. (B) SNP ảnh hưởng đến các mô típ liên kết yếu tố phiên mã của cùng một họ.

 

Kết luận

Nghiên cứu này lần đầu tiên khảo sát các SNP trong vùng promoter của gen LvLTLC1 ở tôm thẻ chân trắng (L. vannamei) và đã phát hiện tổng cộng 24 vị trí SNP. Trong đó, kiểu gen đồng hợp GG tại SNP8 (g.–256 A/G) có tương quan chặt chẽ với khả năng kháng Vibrio mạnh (P < 0,05). Phân tích LD cho thấy SNP9 (g.–249 T/G) và SNP10 (g.–235 A/G) có liên kết cao, với tổ hợp kiểu gen TT/GG thể hiện sự gắn kết đáng kể với tính trạng kháng mạnh. Do đó, kiểu gen GG tại SNP8 và tổ hợp TT/GG của SNP9&SNP10 được xác định là hai chỉ thị phân tử tiềm năng cho tính trạng kháng Vibrio toàn diện (PVR), có giá trị ứng dụng trong chọn giống di truyền tôm thẻ.

ThS. Lê Xuân Chinh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam