[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Nghiên cứu này là phát hiện đầu tiên cho thấy chất kháng khuẩn tự nhiên (AuraAqua) có khả năng làm giảm tác động tàn phá của bệnh Vi bào tử trùng EHP gây ra trên tôm.

Bệnh Vi bào tử trùng do ký sinh trùng nội bào Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra trên tôm, có khả năng lây lan cao sang các trang trại khác và đôi khi giữa các quốc gia. Việc quản lý và theo dõi tình trạng nhiễm EHP thường xuyên không chỉ để kiểm soát và phòng ngừa bệnh hiệu quả mà còn để ngăn ngừa những thay đổi do nhiễm trùng trong hệ vi sinh vật đường ruột của tôm, gây ra những hậu quả nặng nề hơn đối với quá trình chuyển hóa dinh dưỡng và khả năng miễn dịch.

Hỗn hợp các chất kháng khuẩn tự nhiên như AuraAqua (Aq), trước đây đã được chứng minh là làm giảm căng thẳng oxy hóa, tăng cường phản ứng miễn dịch ở các tế bào biểu mô tôm bị nhiễm Nematopsis Messor. Ngoài ra, Aq còn có tác dụng cải thiện sức khỏe đường ruột của các tế bào sơ cấp trong ruột tôm bị nhiễm Vibrio parahaemolyticus (SGP) bằng cách kích thích sự tăng trưởng và phát triển của các vi khuẩn probiotic của vật chủ như Faecalibacter prausnitzii.

Phương pháp nghiên cứu

Hỗn hợp kháng khuẩn tự nhiên AuraAqua, chứa 5% maltodextrin, 1% natri clorua, 42% axit xitric, 18% natri citrat, 10% silica, 12% axit malic, 9% chiết xuất cam quýt và 3% chiết xuất ô liu. Nguyên liệu thô được cung cấp bởi Bio-Science Nutrition Ireland. Các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần. Nồng độ hiệu quả nhất được xác định bằng cách tính phần trăm bào tử EHP thoát ra ngoài. Các bào tử lơ lửng trong 50μL 0,1%, 0,5%, 1% và 2% AuraAqua và ủ trong 24–48 giờ trước khi rửa bằng nước cất. Sự đùn bào tử được kiểm tra dưới kính hiển vi.

Tác động in vitro của EHP và AuraAqua đối với sự sống của SGP trên tôm

Hai phương pháp thử nghiệm đã được thực hiện: (I) cho tế bào biểu mô ruột sơ cấp (SGP) tiếp xúc với 0,1%; 0,5%, 1% và 2% Aq trước khi bị nhiễm bào tử EHP và (II) bao gồm 0,1%, 0,5%, 1% và 2% Aq sau khi nhiễm bệnh và nuôi cấy thêm 24 giờ. Tỷ lệ sống của tế bào SGP được đo bằng xét nghiệm 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT).

Sau khi tiếp xúc với EHP, bằng cách sử dụng phương pháp (I) hoặc (II), các đĩa được ủ trong cùng điều kiện (37oC với 5% CO2) và cuối cùng được rửa bằng 100µL môi trường mới trước khi đo. Tỷ lệ sống của tế bào được đánh giá bằng cách thêm 10µL thuốc thử MTT (0,5 mg MTT/mL) vào mỗi giếng và ủ thêm 3 giờ. Môi trường này sau đó được loại bỏ và 100µL dung dịch hòa tan được thêm vào để hòa tan formazan MTT. Đĩa được ủ qua đêm ở 37°C với 5% CO 2. Khả năng sống của tế bào được biểu thị bằng phần trăm kiểm soát.

Đếm ấu trùng sống sau cảm nhiễm EHP

Tác động của Aq đối với nhiễm EHP cũng được kiểm tra bằng thử nghiệm cảm nhiễm. 120 postlarvae tôm thẻ chân trắng khỏe mạnh được đặt trong đĩa petri vô trùng và tiếp xúc với 2×106 bào tử/giếng trong 24 giờ. Hỗn hợp kháng khuẩn Aq được sử dụng tại thời điểm nhiễm bệnh với nồng độ 0,5% và tỷ lệ sống được xác định sau 24 giờ sau cảm nhiễm. Đối chứng dương tính và âm tính (± hỗn hợp kháng khuẩn hoặc ± ấu trùng) cũng được đưa vào thử nghiệm ở mức 0% hỗn hợp kháng khuẩn, thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại.

Kết quả nghiên cứu

Khả năng sống sót của các tế bào SGP bị nhiễm bào tử EHP

Để xác định tác động của Aq đến hoạt động của bào tử, các bào tử EHP được tiếp xúc với 0,1%, 0,5%, 1% và 2% Aq. Việc tiếp xúc với bào tử EHP trong 24 giờ (Hình 1A) hoặc 48 giờ (Hình 1B) làm giảm đáng kể hoạt động của bào tử ở mọi nồng độ, nhưng rõ rệt hơn sau khi tiếp xúc với 0,5% Aq. Khả năng sống sót của các tế bào SGP bị nhiễm bào tử EHP đã tăng lên đáng kể trong cả hai trường hợp; tuy nhiên, hiệu ứng rõ ràng hơn đã được quan sát thấy khi các tế bào bị nhiễm tiếp xúc trước với Aq (Hình 1C). Những kết quả này cho thấy Aq có thể làm giảm hoạt động của bào tử EHP và tăng khả năng sống sót của các tế bào SGP bị nhiễm EHP.

Hình 1. Ức chế hoạt động của bào tử EHP bởi Aq sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B ). Khả năng sống sót của tế bào SGP sau khi tiếp xúc với các nồng độ Aq khác nhau lây nhiễm trước (C) và trong quá trình lây nhiễm (D)

Tác động stress oxy hóa của Aq trong tế bào SGP

Nghiên cứu chỉ ra rằng sự lây nhiễm EHP của các tế bào SGP sẽ kích hoạt các enzyme NADPH oxyase của vật chủ, một hiệu ứng sẽ được đảo ngược khi thêm 0,5% Aq. Hơn nữa, việc kích hoạt hoạt hóa catalase và superoxidase dismutase không phụ thuộc vào sự tương tác vật lý giữa bào tử EHP và tế bào SGP. Kết quả này đã thúc đẩy thử nghiệm tiếp theo nhằm mục đích điều tra sự liên quan của đường truyền tín hiệu NF-κB trong việc kiểm soát quá trình sản xuất CAT và SOD.

Việc kích hoạt đường dẫn tín hiệu NF-κB p65 được quan sát thấy trong các tế bào SGP bị nhiễm EHP giảm đáng kể khi có 0,5% Aq và có liên quan đến việc mất quá trình phosphoryl hóa P-ser của p65. Khi tôm bị nhiễm EHP và mất ổn định khung tế bào Actin, EHP sẽ kích hoạt NADPH oxydase của vật chủ để tạo ra H 2O2 chịu trách nhiệm kích hoạt oxy hóa con đường NF-κB thông qua quá trình phosphoryl hóa P-ser của p65. Tác động còn được tăng cường hơn nữa bằng cách tăng sản xuất enzyme CAT và SOD khi có mặt 0,5% Aq.

Xác định hiệu ứng In vivo của Aq

Kết quả nghiên cứu cho thấy, 0,5% Aq giảm xuống dưới 20% tỷ lệ chết ở tôm nhiễm EHP sau 24 giờ tiếp xúc (Hình 2A). Catalase theo sau có xu hướng tăng hoạt động (p < 0,0001) khi có 0,5% Aq trong nhóm bị nhiễm EHP (Hình 2B). SOD cũng tăng đáng kể (p = 0,001) trong mô ruột bị nhiễm bệnh và được điều trị (Hình 2C).

Tôm nhiễm EHP được xử lý bằng 0,5% Aq tạo ra mức mRNA của tất cả các AMP này giảm đáng kể (p<0,05) so với đối chứng bị nhiễm bệnh, ngoại trừ PEN4 và lysozyme trong đó mức giảm không đáng kể. Những nghiên cứu này xác nhận rằng Aq có thể làm giảm tác động tiêu cực tôm nhiễm EHP và tăng khả năng sống sót của tôm thẻ chân trắng bằng cách ngăn chặn các hiện tượng tiền viêm được kích hoạt thông qua việc kích hoạt con đường NF-κB.

Hình 2. Ảnh hưởng của 0,5% Aq đến khả năng chống oxy hóa của tôm thẻ chân trắng

(A) Tỷ lệ tử vong, (B) hoạt động CAT và (C) hoạt động SOD.

Kết luận

Nghiên cứu đã chứng minh rằng, hỗn hợp các chất kháng khuẩn tự nhiên Aq có thể ngăn chặn sự trưởng thành của bào tử EHP và giảm nhiễm trùng tế bào biểu mô ruột tôm (Hình 3(1)). Trong ống nghiệm, Aq ngăn chặn quá trình trùng hợp Actin (Hình 3(2)) và làm giảm số lượng bào tử EHP có khả năng lây nhiễm các tế bào SGP (Hình 3(3)). Sự hiện diện của Aq trong quá trình lây nhiễm các tế bào SGP đã ngăn chặn sự kích hoạt của các enzyme NADPH oxyase ( Hình 3(4)), làm tăng biểu hiện CAT và SOD ( Hình 3(5)) và làm giảm mức H2O2 được tạo ra và thả ra (Hình 3(6)). Sự gia tăng sản xuất CAT và SOD có liên quan đến quá trình khử phospho NF-κB (Hình 3(7)). Hơn nữa, việc mất khả năng khử phospho của NF-κB cũng dẫn đến giảm sản xuất AMP (lysozyme, Crustin 1 và 2, và PEN2, 3 và 4) (Hình 3(8)). In vivo cho thấy tỷ lệ chết giảm đáng kể, các sự kiện này có liên quan đến các quan sát được thực hiện trong ống nghiệm, cho thấy sự gia tăng sản xuất CAT và SOD (Hình 3).

Hình 3. Tác động của Aq đến nhiễm trùng EHP in vitro và in vivo sử dụng mô hình lây nhiễm tôm-ruột

Sử dụng hỗn hợp kháng sinh tự nhiên giúp cải thiện việc sử dụng chất dinh dưỡng ở tôm bị bệnh và tăng khả năng chống lại bệnh do vi khuẩn với tác động tích cực đến tỷ lệ sống. Nghiên cứu này là phát hiện đầu tiên cho thấy thuốc kháng khuẩn tự nhiên có khả năng làm giảm tác động tàn phá của bệnh Vi bào tử trùng (EHP) gây tra trên tôm.

Ngọc Anh

(Theo Pharmaceutics 2023)