[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Nghiên cứu này đánh giá thành phần, sự đa dạng và chức năng của hệ vi sinh vật trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng P. vannamei  bị nhiễm EHP trong 30 ngày sau cảm nhiễm mầm bệnh. Những phát hiện này đã nâng cao đáng kể sự hiểu biết các cộng đồng vi sinh vật cụ thể theo từng giai đoạn bệnh trong mô gan tụy của tôm khi bị nhiễm EHP.

 

Phương pháp nghiên cứu

Tôm thẻ chân trắng P. vannamei (~ 5g) có nguồn gốc từ Viện Đại dương (Oahu, Hawaii, Hoa Kỳ), đều được chứng nhận SPF và cho kết quả âm tính với các mầm bệnh bao gồm cả EHP. Trước khi thí nghiệm, tôm được nuôi thuần trong 2 tuần trong hệ thống nuôi tuần hoàn 100 L (25°C) được sục khí nhẹ và cho ăn bằng chế độ ăn dành cho tôm công nghiệp (40% protein).

Trước khi tôm thẻ chân trắng P. vannamei tiếp xúc với tôm bị nhiễm EHP (ngày 0), lấy mẫu mô gan tụy được cắt bỏ vô trùng, một phần được đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng và phần còn lại được cố định trong cồn Davison dung dịch -formalin-axit axetic (AFA). Vào ngày hôm sau, tổng cộng 36 con tôm SPF được chuyển sang bể thử nghiệm nuôi tôm thẻ chân trắng P. vannamei đã nhiễm EHP. Thử nghiệm được tiến hành trong 30 ngày trong khi tôm thí nghiệm được lấy mẫu trong suốt thời gian thử nghiệm. Theo dõi các thông số môi trường: Nhiệt độ, độ mặn, pH…

Hình 1: Thiết kế thí nghiệm

Kết quả nghiên cứu

Mô bệnh học kỹ thuật số: Phát hiện EHP và định lượng mức độ nghiêm trọng của nhiễm bệnh

5 cấp độ nhiễm trùng trong gan tụy của tôm đồng nhiễm được chỉ định theo Lightner: I0, I1, I2, I3 và I4 có liên quan (P  <0,05) với giá trị EII là 0%; 0,004–0,14%; 0,51– 5,92%; 6,85–9,26% và 10,15–45,67% tương ứng (Hình 2). Tổng cộng có 3 giai đoạn của bệnh được sử dụng để mô tả chu kỳ lây nhiễm: giai đoạn đầu, giai đoạn phát triển và giai đoạn cuối (Hình 3A) hỗ trợ bởi EII được đánh giá theo cấp độ nhiễm trùng (I0–I4) theo từng giai đoạn bệnh (sớm-muộn) (Hình  3B) và giá trị trung bình cho từng giai đoạn bệnh (Hình 3C).

Hình 2: Thang cấp độ cường độ nhiễm EHP. Mức độ lây nhiễm được đánh giá bằng phép lai tại chỗ (ISH) sử dụng chỉ số lây nhiễm EHP (EII)

Hình 3: Đánh giá nhiễm EHP. (A) Cấp nhiễm EHP (I0–I4); (B) cấp nhiễm theo từng giai đoạn bệnh; (C) giá trị trung bình cho từng giai đoạn bệnh.

Giai đoạn đầu bao gồm 12 ngày đầu tiên sau khi nhiễm bệnh (dpi), trong đó giá trị trung bình EII thấp hơn (0,92 ± 3,06%). EHP chỉ được phát hiện ở một con tôm được lấy mẫu ở 9 và 12 dpi. Sau giai đoạn đầu, tất cả tôm lấy mẫu đều dương tính với EHP (I1–I4). Giai đoạn phát triển bắt đầu từ 15 và kết thúc ở 24 dpi và đi kèm với giá trị trung bình cao hơn của EII (8,08 ± 13,75%). Giai đoạn này được đặc trưng bởi sự gia tăng của tôm bị nhiễm bệnh ở cấp độ nhiễm bệnh cao (I3 và I4) và tôm ở cấp độ I4 có giá trị EII cao nhất (31,97 ± 19,37%) trong suốt quá trình thử nghiệm. Ở giai đoạn cuối (27 đến 30 dpi), số lượng tôm có cường độ nhiễm cao (I3 và I4) giảm và giá trị trung bình EII giảm (5,44 ± 6,28%). Ở giai đoạn cuối, quan sát thấy một mô hình tiệm cận khi tôm đang trong quá trình lây nhiễm theo chu kỳ. Theo những kết quả này, EHP có thể sinh sôi nảy nở cho đến khi tôm đạt độ nhiễm trùng I4 và sau đó tải lượng ký sinh trùng bắt đầu giảm cho đến khi tôm đạt độ nhiễm trùng I1. Mô hình này có thể được lặp lại trong suốt chu kỳ nuôi cấy. EHP có thể sinh sôi nảy nở cho đến khi tôm đạt độ nhiễm trùng I4 và sau đó tải lượng ký sinh trùng bắt đầu giảm cho đến khi tôm đạt độ nhiễm trùng I1.

 

Phân tích thành phần vi sinh vật

Trong số các vi khuẩn, phân loại phân cấp được chỉ định cho phép xác định hai miền, vi khuẩn (97–100%) và vi khuẩn cổ (<3%). Tổng cộng có 20 vi khuẩn (11 chưa được phân loại) và 3 vi khuẩn cổ đã được xác định và phân loại thành 234 chi (215 chưa được phân loại). Trong số các loại nấm, một miền đã được xác định. Tổng cộng có 3 ngành nấm đã được xác định và phân loại thành 32 chi (5 loại chưa được phân loại). Ngành đại diện nhất được tìm thấy trong số các vi khuẩn bao gồm Proteobacteria (12–98%), Firmicutes (1–24%) và Tenericutes (0,3–82%) (Hình 4A) trong khi Basidiomycota (0–99%) và Ascomycota (0– 99%) có nhiều nhất trong số các loại nấm (Hình 4B). Sự khác biệt giữa các giai đoạn bệnh ở cấp độ ngành chỉ được nhìn thấy ở nấm, trong đó việc giảm Ascomycota phyla đi kèm với sự gia tăng của Basidiomycota phyla ở giai đoạn cuối của bệnh.

Các chi đại diện nhiều nhất ở vi khuẩn là Pseudomonas (0,7–80%) (Hình 4A) và ở nấm Naganishia (0–97%) (Hình 4B). Ở vi khuẩn Agrobacterium, Actinobacteria Delftia, Comamonas, Pseudomonas và được nhóm riêng biệt với các chi khác như Streptococcus , Anoxybacillus , Loktanella , Methylobacterium và Vibrio (Hình  4A). Ở nấm, hầu hết các chi được nhóm lại với nhau ngoại trừ Naganisha (Hình 4B).

Hình 4: Hệ vi sinh vật của tôm theo cấp độ ở các giai đoạn bệnh khác nhau. Trong đó (A) vi khuẩn và (B) phân loại nấm.

Ở nấm, hầu hết các con đường trao đổi chất có liên quan đến chuyển hóa carbohydrate bao gồm cả sự thoái hóa glycan. Điều này cho thấy rằng nấm ở giai đoạn cuối có thể lợi dụng nguồn dự trữ carbohydrate của tôm bị nhiễm EHP. Giả thuyết này được hỗ trợ bởi các phân tích phiên mã, proteomic và chuyển hóa trong đó quá trình chuyển hóa năng lượng như phân hủy, tiêu hóa và hấp thụ carbohydrate được điều hòa bởi sự lây nhiễm EHP.  Đề xuất nhiễm trùng EHP dẫn đến một quá trình thoái hóa mãn tính theo chu kỳ gây ra rối loạn vi khuẩn (Hình 8). EHP phát triển khi dự trữ gan tụy cao đạt được cường độ lây nhiễm cao (I4) và khi dự trữ chất dinh dưỡng bị cạn kiệt, sự sinh sôi của mầm bệnh sẽ dừng hoặc giảm. Nếu điều kiện thuận lợi, tôm sẽ tạm thời phục hồi và gan tụy một lần nữa sẽ trở thành ổ thích hợp cho EHP.

Hình 5: Sơ đồ thể hiện những thay đổi chính được tạo ra trong gan tụy của tôm trong quá trình lây nhiễm EHP (30 ngày) theo các giai đoạn bệnh trong nghiên cứu

Kết luận

Bệnh vi bào tử trùng EHP gây ra ở tôm thẻ chân trắng P. vannamei có thể làm mất đi sự đa dạng, vi sinh vật có lợi và chức năng liên quan đến việc thu nhận chất dinh dưỡng và sức khỏe của tôm (rối loạn vi khuẩn). Nhiễm EHP càng kéo dài với cường độ nhiễm trùng cao hơn thì sẽ thấy sự thay đổi rõ ràng hơn của hệ vi sinh vật gan tụy. Nghiên cứu xác định sự gia tăng số lượng vi khuẩn Vibrio, Aquimarina và Leadbetterella và nấm Malassezia . Các vi sinh vật có lợi bị thay thế trong quá trình nhiễm EHP bao gồm các vi khuẩn như Bacteroides, Pseudomonas, Acinetobacter, Agrobacterium, Delftia, Achromobacter, Comamonas cũng như các loài thuộc họ Bacillaceae và nấm Komagataella . Một số loại này có thể được nuôi cấy và sử dụng làm chế phẩm sinh học để làm giảm bớt sự phát triển của bệnh vi bào tử trùng EHP.

Ngọc Anh (Lược dịch)