[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Mục đích của nghiên cứu này là xác định các tinh dầu EOs có thể can thiệp vào QS của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng.

 

Mặc dù tốc độ tăng trưởng ngành nuôi tôm tăng đáng kể, tuy nhiên vẫn liên tục bị tấn công bởi các mầm bệnh do virus và vi khuẩn gây ra. Gần đây, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn Vibrio mới có độc lực cao, có khả năng gây tử vong nghiêm trọng. Hầu hết các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh đã cho thấy khả năng kháng với các loại kháng sinh thông thường, gây khó khăn cho việc kiểm soát chúng trong các hệ thống sản xuất nuôi trồng thủy sản. Ở một mức độ lớn, sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc là do việc sử dụng sai thuốc kháng sinh, thường được người nuôi áp dụng để điều trị bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra.

 

Vật liệu và phương pháp điều trị

Đánh giá chủng vi khuẩn, điều kiện phát triển và tinh dầu

Bốn vi khuẩn Vibrio được sử dụng trong nghiên cứu này là V. harveyi (chủng E22), V. campbellii (vết LM2013), V. parahaemolyticus (chủng ATCC 27969) và V. vulnificus (chủng S2). Tất cả các chủng đều được nuôi cấy trong môi trường thạch Luria Bertani.

Năm loại tinh dầu (EOs) đã được đánh giá, đó là tinh dầu của Organum vulgare (EOOv), Melaleuca alternifolia (EOMa), Cymbopogon citratus (EOCc), Cinnamomum verum (EOCv) và Thymus vulgaris (EOTv).

Đối với các xét nghiệm chống QS, các EOs đã được nhũ hóa. Trước đây người ta đã xác định rằng liều lượng của chất được sử dụng làm chất nhũ hóa không ảnh hưởng đến các thông số được đánh giá.

Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của EOs được xác định để thiết lập liều Sublethal, chỉ ảnh hưởng đến các chỉ số QS về phát quang sinh học, phát triển màng sinh học và khả năng di chuyển của vi khuẩn, mà không ảnh hưởng đến khả năng sống của vi khuẩn.

Đối chứng dương (có chứa vi khuẩn nhưng không có EOs) và đối chứng âm (có chứa EOs nhưng không có chứa vi khuẩn) đã được bao gồm trên mỗi vi tấm, được lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ Eos và đối chứng.

Hình 1. Tinh dầu ảnh hưởng đến sự phát triển của các chủng Vibrio (A) V. harveyi, (B) V. campbellii, (C) V. vulnificus và (D) V. parahaemolyticus. Tất cả các nồng độ được khảo nghiệm đối với bốn loài Vibrio.

 

Ảnh hưởng của EOs đến sự phát quang sinh học và sự hình thành màng sinh học

Đánh giá ảnh hưởng của EOs lên màng sinh học của bốn chủng vi khuẩn Vibrio là V. harveyi, V. campbellii, V. parahaemolyticus và V. vulnificus. Sinh khối màng sinh học của vi khuẩn được nhuộm bằng tinh thể tím (CV) và đo quang phổ định lượng. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn cho mỗi chủng Vibrio. Một đối chứng được thực hiện có chứa huyền phù vi khuẩn không có EO với sáu lần lặp lại cho mỗi nồng độ. Các tế bào sinh vật phù du đã bị loại bỏ và các màng sinh học được tạo ra đã được rửa cẩn thận hai lần. Các đĩa này sau đó được rửa để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa và làm khô ở nhiệt độ phòng.

Ảnh hưởng của EO đến khả năng vận động

Ảnh hưởng của các EO đối với khả năng di chuyển của bốn loài Vibrio cũng đã được đánh giá. LBb bổ sung đã được hấp tiệt trùng. Sau khi LB môi trường được làm lạnh đến 45 ± 3⁰C, các EO được thêm riêng rẽ vào từng nồng độ cần đánh giá. LB môi trường được đổ vào các đĩa Petri và các đĩa này được làm khô trong 15 phút và ngay sau đó cấy vi khuẩn Vibrio vào giữa các đĩa.

Các đĩa được ủ ở 26⁰C trong 72 giờ và sự di chuyển của vi khuẩn được đo bằng mm. Sự di chuyển của các vi khuẩn được xử lý với EOs được so sánh với sự di chuyển của các vi khuẩn không được điều trị.

Độc tính in vitro và in vivo của EOs

Để xác định mức độ an toàn của EOs in vivo, ấu trùng P. vannamei được sử dụng ở ba giai đoạn ấu trùng, Zoea 1 (Z-1), Mysis 1 (M-1) và hậu ấu trùng (PL-3) được cung cấp bởi một trại giống thương mại. Mỗi thử nghiệm được thực hiện độc lập. Nước được sử dụng trong các thử nghiệm đã được lọc và khử trùng trong nồi hấp. Các tinh dầu EO được áp dụng sau 8 giờ đến tổng lượng nước của mỗi đơn vị thí nghiệm. Đối chứng là ấu trùng không tiếp xúc với EO. Ấu trùng được theo dõi trong 96 giờ. Dữ liệu được chuyển đổi thành tỷ lệ phần trăm sống sót, coi 100% là tỷ lệ sống sót của ấu trùng không nhận EO. Ngoài ra, dữ liệu thu được xác định liều lượng gây chết 50% (LD50) cho mỗi giai đoạn ấu trùng của tôm.

Tác dụng chống độc lực in vivo của EOs và hiệu quả của việc áp dụng EOs trong ao nuôi thương phẩm P. vannamei

Hiệu quả chống độc lực của EOs đã được xác minh bằng một thử nghiệm sử dụng ấu trùng P. vannamei khỏe mạnh ở giai đoạn này. Chất cấy vi khuẩn đã được chuẩn bị và để đối chứng, việc nuôi cấy V. campbellii không có EO đã được thực hiện.

Các bình nuôi cấy đã được ủ. Sau đó, các mẫu cấy được ly tâm, loại bỏ phần nổi phía trên và các tế bào viên được nối lại và ngay lập tức được cấy vào mỗi nghiệm thức được chỉ định. Thử nghiệm sinh học này xem xét 100% độc lực của chủng vi khuẩn V. campbellii được nuôi cấy mà không có EO.

Cho ăn hàng ngày ban đầu được đặt ở mức xấp xỉ 3% trọng lượng cơ thể trung bình của tôm và được điều chỉnh hàng tuần dựa trên mức tiêu thụ thức ăn và tốc độ tăng trưởng quan sát được. Tỷ lệ sống của tôm cuối cùng (%), trọng lượng trung bình (g), năng suất sản xuất (kg / ha) và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) được đánh giá tại thời điểm thu hoạch.

 

Kết quả nghiên cứu

Xác định liều Sublethal của EOs và ức chế phát quang sinh học

Các EO thể hiện các giá trị MIC và MBC khác nhau so với bốn chủng Vibrio được đánh giá. Giá trị MIC và MBC thấp nhất đối với EOOv và EOMa, cho thấy hoạt động ức chế và diệt khuẩn của chúng mạnh hơn so với các loại tinh dầu khác được đánh giá.

Kết quả chỉ ra rằng không có EO nào ảnh hưởng đến sự phát triển của bốn vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở nồng độ cao nhất được thử nghiệm. Chỉ có EOOv và EOMa làm giảm đáng kể sự phát quang sinh học của V. harveyi và V. campbellii.

Phần trăm ức chế phát quang sinh học trong mỗi dòng vi khuẩn cho thấy sự phụ thuộc rõ rệt vào nồng độ đối với trường hợp của EOOv và EOMa. EOOv là dầu hiệu quả nhất để ức chế sự phát quang sinh học.

EOs ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh học và di chuyển của vi khuẩn

EOCc, EOCv và EOTv không ức chế sự hình thành màng sinh học trong bốn loại vi khuẩn Vibrio gây bệnh được đánh giá, vì vậy chúng không được xem xét thêm cho thử nghiệm khả năng vận động và thử nghiệm in vivo.

EOOv và EOMa đã làm giảm đáng kể màng sinh học của bốn Vibrio phụ thuộc vào nồng độ.

EOOv là loại dầu hiệu quả nhất trong việc giảm hơn 50% màng sinh học của bốn loại vi khuẩn gây bệnh trong mỗi trường hợp.

Thuốc kháng sinh Oxytetracycline ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn Vibrio kém hiệu quả hơn so với các tinh dầu EOs, đặc biệt là ở V. parahaemolyticus. Khả năng di chuyển của bốn vi khuẩn Vibrio gây bệnh bị ảnh hưởng bởi các EO phụ thuộc vào nồng độ.

Hình 2. Ảnh hưởng của tinh dầu và Oxytetracycline đối với các chủng Vibrio. Tất cả các hình ảnh được ghi lại sau 72 giờ ủ. Nồng độ bài luận là: Tinh dầu oregano (EOOv) 1,0 μgmL-1; tinh dầu cây chè (EOMa) 5,0 μgmL-1; kháng sinh (Oxytetracycline) 10,0 μgmL-1; đối chứng: không có tinh dầu hoặc chất kháng sinh được thêm vào

 

Đối với thử nghiệm về khả năng vận động Oxytetracycline, chúng tôi chọn chủng V. vulnificus do khả năng di chuyển của nó bao phủ toàn bộ đĩa Petri trong 96 giờ. Trong nghien cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng EO cũng ảnh hưởng đến tình trạng kháng thuốc kháng sinh. Vì EOs làm giảm khả năng vận động của V. vulnificus, vòng vô khuẩn Oxytetracycline khi có EOs được giữ cho đến khi kết thúc thí nghiệm 96 giờ. Ở nhóm đối chứng, vòng vô khuẩn giảm dần theo thời gian.

Hình 3. Tinh dầu có tác dụng làm giảm nhu động của V. vulnificus khi có mặt của kháng sinh Oxytetracycline. Sau 96 giờ.

 

Độc tính in vitro và in vivo của EOs và tác dụng có lợi của EOs trong ao nuôi thương phẩm P. vannamei

Các thử nghiệm độc tính in vivo của EOs cho thấy giai đoạn ấu trùng càng sớm, độ nhạy cảm của chúng với EOs càng lớn. Trong giai đoạn Zoea, hai EOs ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ sống sót trong hầu hết các liều lượng được đánh giá. Về giai đoạn Mysis, EOs chỉ cho thấy tác động tiêu cực đến sự sống khi ở liều cao nhất được đánh giá.

Đối với tôm giống, EOOv chỉ giảm tỷ lệ sống ở nồng độ 10,0 μgmL-1, và EOMa không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tôm giống ở bất kỳ nồng độ nào được đánh giá.

Sự khác biệt đáng kể đã được ghi nhận giữa tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng P. vannamei đối với V. campbellii được nuôi khi có và không có tinh dầu EOs. Đối với nhóm đối chứng tỷ lệ sống và năng suất tích lũy được cải thiện đáng kể (P <0,05) trong các ao được xử lý bằng EOOv ở cả hai liều lượng được đánh giá. Đối với EOMa, chỉ ở liều cao nhất (5,0 mg kg-1) tỷ lệ sống và năng suất cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng.

 

Kết luận

Nghiên cứu cho thấy, EOOv và EOMa cho kết quả đáng khích lệ khi sử dụng thức ăn bổ sung trong ao nuôi tôm; ức chế sự phát quang sinh học của V. harveyi và V. campbellii; ngăn chặn sự hình thành màng sinh học ở bốn vi khuẩn Vibrio; thu được tỷ lệ sống và sản lượng cao hơn trong các ao nuôi thương phẩm. Chính vì vậy, EOOv và EOMa có thể ức chế các quá trình qua trung gian QS ở bốn loại vi khuẩn Vibrio gây bệnh liên quan đến nuôi tôm.

Các quan sát từ các thử nghiệm in vitro cho phép xác định liều lượng hoạt chất cho các thử nghiệm in vivo, trong đó EOOv và EOMa làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tôm thử nghiệm với vi khuẩn V. campbellii.

Khả năng của EOs trong việc ức chế vận động ngay cả khi có mặt kháng sinh Oxytetracycline, kết quả cho thấy ứng dụng bổ sung của EOs, làm tăng hiệu quả của kháng sinh. Trong nghiên cứu này, EOOv là hiệu quả nhất để ức chế các quá trình qua trung gian QS trong bốn Vibrio được đánh giá.

Ngọc Anh (Lược dịch)