[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Viral Covert Mortality Disease (VCMD) còn được gọi là bệnh tôm chết bí ẩn do Nodavirus, một loại Nodavirus RNA sợi đơn dương tính được phân loại trong họ Nodaviridae gây ra.

LCSM có khả năng thay thế hoàn toàn RSS, giảm chi phí sản xuất tổng thể trong các hệ thống sản xuất trong nhà và thúc đẩy nuôi tôm thẻ chân trắng ở Mỹ và nhiều nơi khác.

 

Trong 6 tháng cuối năm 2021, Trung Quốc ghi nhận các hiện tượng chết bất thường của tôm thẻ chân trắng nuôi tại các hệ thống trong nhà ở các trang trại địa phương thuộc thành phố Đông Đình và thành phố Duy Phường. Hơn 80% các trang trại nuôi tôm ở các địa phương này đã bị ảnh hưởng.Tôm bị chết thường có triệu chứng teo gan tụy, rỗng ruột và mềm vỏ. Nuôi tôm thâm canh trong nhà có mái che là một trong những phương thức nuôi trồng thủy sản quan trọng của địa phương, và nước mặn ngầm là nguồn nước chính được sử dụng. Nguồn nước được sục khí, duy trì nhiệt độ trong khoảng 28–30°C, và độ mặn là 18–25‰. Trong suốt thời gian nuôi, tôm được cho ăn bằng mồi hỗn hợp và mồi đông lạnh (Artemia sp. và Acetes sp.). Tỷ lệ mắc bệnh của tôm được đặc trưng bởi hiện tượng tôm chết rải rác trong thời gian dài. Thời gian khởi phát chủ yếu xảy ra ở hai giai đoạn phân tách quần thể ấu trùng tôm và giai đoạn tách đàn tôm con (thao tác tách đàn được sử dụng để giảm mật độ nuôi trong quá trình nuôi trong nhà). Mật độ nuôi là 500–1.000 con/m² sau khi ấu trùng tôm tách ra. Tỷ lệ chết sẽ được quan sát khi bắt đầu từ 3–7 ngày sau khi chuyển ao. Vào thời kỳ đầu của bệnh (sau khi đàn tôm tách đàn để giảm mật độ trong ao), số lượng tôm chết ít, nhưng số lượng tôm chết lên đến 100–150 con/ao chỉ sau 7 ngày.

Tôm chết tiếp tục, với số lượng tôm chết cao, vượt quá 150 kg/ao ở thời điểm 3 ngày sau khi phát bệnh ở một số trại tôm thương phẩm. Cá thể tôm bị bệnh (chiều dài cơ thể khoảng 5–10cm) có các triệu chứng lâm sàng rõ ràng, bao gồm teo gan tụy với màu sắc nhạt dần, dạ dày và ruột rỗng, vỏ mềm (Hình 1). Hiện tượng trắng và hoại tử cơ nhẹ xảy ra ở hầu hết các cá thể tôm, và một số cá thể bị bệnh ở giai đoạn cấp tính cho thấy phần cơ bụng bị trắng với tỷ lệ lớn (Hình 1). Trong khi đó, tôm bệnh có sức sống yếu và thường chìm xuống đáy ao, không di chuyển được và đặc biệt có tăng trưởng khá chậm.

Hình 1: Hình ảnh đại diện của tôm thẻ chân trắng bị bệnh từ các trang trại. Hầu hết các cá thể tôm bị bệnh đều có hội chứng teo gan tụy với màu sắc nhạt dần, dạ dày và ruột trống rỗng, vỏ mềm, trắng cơ nhẹ và hoại tử (mũi tên đỏ), như cá thể ở trên

 

Vào tháng 12 năm 2021, phòng thí nghiệm của nhóm nghiên cứu đến từ Đại học Hải dương Thượng Hải và Viện Khoa học Thủy sản Trung Quốc đã được yêu cầu thực hiện một cuộc điều tra về tình hình dịch bệnh này. Bốn trang trại nuôi trồng thủy sản bán thâm canh trong nhà đã được lựa chọn để thu mẫu. Tổng cộng 28 mẫu tôm bệnh (khoảng 3–8g) và thức ăn tươi sống (Artemia sp. Và Acetes sp.) đã được lựa chọn để tiến hành các phân tích chuyên sâu. Các cephalothoraxes và mẫu cơ từ cá thể tôm được chia thành bốn phần và sau đó được bảo quản ngay lập tức trong dung dịch paraformaldehyde 4%, (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.), glutaraldehyde 2,5% và dung dịch ethanol 95%. RNA tổng số được chiết xuất từ các mẫu được bảo quản trong dung dịch RNAstore bằng RNAiso Plus (Takara, Đại Liên, Trung Quốc). DNA được chiết xuất bằng cách sử dụng Bộ DNA TIANamp (Tiangen, Bắc Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Độ tinh khiết và nồng độ của tất cả các mẫu RNA và DNA được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Nồng độ axit nucleic cho tất cả các mẫu được pha loãng đến ~ 200 ng/μL với tỷ lệ độ hấp thụ từ 1,8 đến 2,1 ở 260 và 280.

Theo các triệu chứng của tôm bệnh, 7 mầm bệnh phổ biến trên tôm (tức là CMNV, VpAHPND, SHIV, EHP, IHHNV, IMNV và WSSV). Đối với CMNV, phương pháp được sử dụng là PCR định lượng phiên mã ngược dựa trên thăm dò TaqMan (RT-qPCR) thời gian thực được thực hiện bằng một giao thức cụ thể (Li và cộng sự, 2018). Để phát hiện VpAHPND, bộ chẩn đoán nhanh đã được sử dụng. Và SHIV được định lượng trong tất cả các mẫu bằng đầu dò TaqMan qRT-PCR theo phương pháp đã báo cáo trước đây (Qiu và cộng sự, 2018). Tất cả các mẫu được xử lý bởi một phòng thí nghiệm độc lập bằng cách sử dụng qPCR thời gian thực của đầu dò TaqMan, để phát hiện EHP (Y.M. Liu và cộng sự, 2018). IHHNV, IMNV và WSSV được phát hiện bằng phương pháp được OIE khuyến nghị (OIE, 2021). Tất cả các mẫu được khuếch đại và chuẩn bị để giải trình tự bằng cách sử dụng quy trình phản ứng chuỗi polymerase lồng nhau hai bước, phiên mã ngược (RT-nPCR) với hai cặp mồi. Cụ thể hơn, các sản phẩm khuếch đại (619 bp) của PCR bước 1 đã thu được bằng cách sử dụng PrimeScript ™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa, Đại Liên, Trung Quốc). Sau đó, PCR thứ cấp được thực hiện bằng cách sử dụng TaKaRa Ex Taq® Hot Start Version (TaKaRa, Dalian, China) với các mẫu của sản phẩm RT-PCR bước 1 để thu được sản phẩm mục tiêu 413 bp. Các quy trình và mồi được sử dụng giống với những quy trình được mô tả như đã báo cáo trước đây (Wang và cộng sự, 2021b). Sau khi khuếch đại, các sản phẩm được tách ra trong điện di trên gel agarose và các dải được xác minh trình tự tại Sangon Biotech (Thượng Hải, Trung Quốc) Co., Ltd. Trình tự được xác định thông qua tìm kiếm BLAST và trình tự axit amin suy ra của đoạn gen RdRp đích CMNV từ các mẫu dương tính và trình tự axit amin RdRp từ virus khác đã được chọn để phân tích phát sinh loài bằng cách sử dụng phần mềm MEGA X (Kumar và cộng sự, 2018).

 

Hình 2: Cây phát sinh loài của các phân lập CMNV khác nhau và các loại nodaviruses khác dựa trên gen RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) được tạo ra bằng phương pháp nối sử dụng MEGA X. Bar = 0,5.

 

Kết quả cho thấy CMNV (covert mortality nodavirus) được phát hiện trong tất cả 26 mẫu bởi TaqMan qPCR. Trong số đó, tải lượng vi rút trong 82% (23/28) mẫu vượt quá 103 bản sao/ μg RNA mô tổng số. Ngoại trừ một trong các mẫu, tải lượng virus của các mẫu còn lại đều cao hơn 102 bản sao/ μg RNA mô tổng số. Ngoài ra, 75% (9/12) cá thể tôm được phát hiện dương tính với EHP và tải trọng trong các mẫu nằm trong khoảng 101–4 bản sao/ μg DNA mô tổng số. Hơn nữa, không có VpAHPND, IHHNV, IMNV, WSSV và SHIV nào được phát hiện trong tất cả các mẫu. Sau khi khuếch đại PCR thông thường, tất cả các sản phẩm PCR thứ cấp được phát hiện bằng cách chạy gel agarose, và các dải đơn của amplicon gen mục tiêu 413 bp được phát hiện trong tất cả các mẫu, cũng như trong đối chứng dương tính (Hình 2). Trình tự của các sản phẩm PCR được phân tích BLAST. Các phân tích BLAST chỉ ra rằng tất cả các trình tự của gen CMNV RdRp từ các mẫu thu thập được cho thấy mức độ nhận dạng nucleotide cao tới 98–100% với chủng CMNV ban đầu (số Gen: KM112247.1) từ tôm bệnh. Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng tất cả các đoạn mục tiêu CMNV từ ba dòng phân lập khác nhau của trang trại được tập hợp thành một nhánh của dòng phân lập CMNV đã biết, chứng tỏ sự tương đồng cao hơn với chi Alphanodavirus hơn là Betanodavirus (Hình 2).

Kiểm tra mô học xác nhận rằng các thay đổi mô bệnh học xảy ra ở nhiều mô và cơ quan của tôm bệnh bị nhiễm CMNV. Các ống gan tụy bị hoại tử với sự teo và bong tróc của các tế bào biểu mô ống. Trong khi đó, thâm nhiễm hồng cầu, karyopyknosis và các thể bao gồm bạch cầu ái toan được quan sát thấy giữa các ống gan tụy bị teo (Hình 3a và b). Ngoài ra, chứng karyopyknosis mở rộng và ly giải cơ nghiêm trọng và xơ hóa sợi cơ mà ranh giới tế bào biến mất đã được quan sát thấy trong các tổn thương cơ màu trắng (Hình 3e và f). Hơn nữa, việc kiểm tra Hình 3j cho thấy sự hút chân không lớn trong tế bào chất của dây thần kinh bụng. Hơn nữa, sự hoại tử và bong tróc của các tế bào biểu mô ruột cũng được quan sát thấy ở tôm bị bệnh (Hình 3n).

Hình 3: Ảnh nhuộm haematoxylin và eosin (H&E) và lai tại chỗ (ISH) của mô và cơ quan chính của tôm thẻ chân trắng bị nhiễm CMNV.

 

Một thử nghiệm khác được tiến hành để xác nhận thêm khả năng gây bệnh của CMNV được phân lập từ mồi đông lạnh Artemia sp. Kết quả thử thách cho thấy tỷ lệ chết tích lũy của P. vannamei ở nhóm tiêm virus là 31,5% sau khi tiêm vào ngày thứ 7. Trong khi đó, không có tỷ lệ chết của P. vannamei trong nhóm đối chứng được tiêm đệm TN (Hình 4). Hơn nữa, phân tích RT-qPCR chỉ ra rằng các cá thể tôm từ nhóm nhiễm bệnh dương tính với CMNV với liều lượng virus thay đổi, trong khi tôm từ nhóm đối chứng âm tính với CMNV.

Hình 4: Phân tích khả năng gây bệnh của CMNV được phân lập từ Artemia

 

Nhìn chung, tôm lấy mẫu từ các trang trại địa phương trong thời kỳ bùng phát dịch bệnh cho thấy các triệu chứng lâm sàng và bệnh lý nghiêm trọng, điển hình liên quan đến nhiễm CMNV. Tôm mập mạp với các mảng màu trắng trên cơ bụng ở giai đoạn cấp tính nhiễm virus thường được tìm thấy ở đáy ao thay vì bơi lên bề mặt hoặc rìa. Hiện tượng này phù hợp với hiện tượng đã quan sát trước đây ở P. vannamei bị nhiễm CMNV (Zhang và cộng sự, 2014). Mặc dù một số virus RNA đã được phát hiện là nguyên nhân gây ra hiện tượng trắng cơ và hoại tử điển hình của tôm nuôi, nhưng nó có phần khác với nhiễm CMNV. Ví dụ, tôm bị nhiễm virus gây bệnh Myonecrosis truyền nhiễm (IMNV) sẽ có dấu hiệu rõ ràng là các vùng hoại tử màu trắng trên diện rộng ở cơ xương, đặc biệt là ở đoạn bụng thứ sáu và quạt đuôi, có thể bị hoại tử và đỏ ở một số tôm (Lightner et al., 2004, Poulos và cộng sự, 2006).

Tương tự, Penaeus vannamei gật gù (PvNV) nhiễm P. vannamei gây hoại tử cơ, nhưng tỷ lệ tử vong thấp hơn so với nhiễm CMNV (Tang et al., 2007, Zhang et al., 2014). Các mô hoặc cơ quan đích chính của CMNV không hoàn toàn phù hợp với IMNV, MrNV và PvNV. Trong trường hợp này, kết quả mô bệnh học cùng với ISH cho thấy biểu mô ống gan tụy bị teo và hoại tử với tín hiệu lai CMNV dương tính với màu tím khổng lồ đã được chứng minh, cung cấp bằng chứng đáng tin cậy rằng gan tụy là một trong những bệnh quan trọng cơ quan đích của CMNV. Trong khi đó, các hạt giống CMNV cũng được quan sát thấy trong mô gan tụy dưới TEM. Nhưng cho đến nay, không có báo cáo nào chứng minh rằng gan tụy bị teo và hoại tử do nhiễm MrNV, PvNV và IMNV. Các bằng chứng trên đã ủng hộ mạnh mẽ rằng CMNV là tác nhân gây ra dịch tôm ở thành phố Đông Đình và Duy Phường.

Chinh Lê