[Tạp chí Người Nuôi Tôm] – Nghiên cứu cho thấy thuốc nhuộm huỳnh quang Calcofluor-white (CFW) được sử dụng đã phát hiện các bào tử Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) trong phân và gan tụy bị nhiễm bệnh của tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei).

Nhuộm CFW cung cấp một phương pháp đơn giản và nhanh chóng để xác định sự hiện diện của bào tử EHP trong các mẫu tôm.

Trong thập kỷ qua, tốc độ tăng trưởng chậm của tôm ngày càng được báo cáo nhiều ở châu Á, có liên quan đến nhiễm vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP). Bào tử trưởng thành của EHP có hình bầu dục và kích thước ~1,1–1,7μm × 0,7–1,0μm, dựa trên các báo cáo khác nhau (Rajendran & cs., 2016). Việc phát hiện và quan sát các bào tử trưởng thành chủ yếu dựa vào việc nhuộm toluidine blue (Ignatius & cs., 1997), phloxine (Aldama-Cano & cs., 2018), Giemsa (Rajendran & cs., 2016), hoặc Hematoxylin và Eosin (HE). Tuy nhiên, các bào tử EHP vẫn khó quan sát khi sử dụng các phương pháp nhuộm này do sự giao thoa màu sắc của mô ký chủ (Chang & cs., 2019).

Calcofluor – white (CFW) là thuốc nhuộm màu xanh huỳnh quang liên kết đặc hiệu với β-1,3 và β-1,4 polysaccharid trong cellulose và chitin (Kumar & cs., 2009) và phát huỳnh quang ở bước sóng 395 – 415nm. CFW có thể được sử dụng như một phương pháp phát hiện nhanh chóng nhiều loại nấm gây bệnh bao gồm: Microsporidia, Acanthamoeba, Pneumocystis, Naegleria và Balamuthia (Qiao & cs., 2018) và phù hợp với mọi loại mẫu, bao gồm mẫu tươi, cố định, các mô đông lạnh và nhúng parafin (Afshar & cs., 2018). Trong nghiên cứu này, cung cấp một phương pháp chẩn đoán đơn giản cho bào tử EHP bằng CFW.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

CFW (Sigma, Đức) là hỗn hợp thuốc nhuộm của Calcofluor – white (1 g/L) và Evans blue (0,5 g/L). Evans blue hiện diện trong thuốc nhuộm hoạt động như một chất cản quang và làm giảm huỳnh quang nền của các mô và tế bào. Tuy nhiên, CFW có thể gây kích ứng mắt và Evans blue có thể gây ung thư. Do đó, thiết bị bảo vệ cá nhân được khuyến khích. Các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus sp., Staphylococcus sp. và Vibrio harveyi được bảo quản trong phòng thí nghiệm.

Nhuộm CFW của bào tử EHP

Các bào tử EHP đã được tinh sạch bằng phương pháp ly tâm từ 1g gradient nồng độ gan tụy của P. vannamei bị nhiễm EHP với tỷ lệ 4,7±2,2 × 104 CFU/ng-DNA. Tên tiêu bản với 10 µl bào tử đã ly tâm được nhuộm bằng một giọt dung dịch CFW (CFW:10% KOH = 1:1). Phiến kính được đặt ở nhiệt độ phòng (25°C) trong 5–10 phút, sau đó được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng kích thích 340–380nm và bước sóng phát xạ 400nm với vật kính dầu 100 × và được chụp ảnh bằng phần mềm NIS-Elements BR phiên bản 4.50 (Nikon, Nhật Bản).

Nhuộm CFW bào tử EHP trong phân

Phân được thu vào ống ly tâm 1,5mL từ tôm sống bị nhiễm EHP nuôi trong bể nhựa 40L. Sau khi loại bỏ nước dư thừa, phân được đồng nhất nhẹ nhàng bằng thanh mài nhựa và đặt trên phiến kính. Nhỏ 1 giọt CFW sau đó được thêm vào phân và trộn đều. Các bào tử trong phân được nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 5–10 phút và được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Nhuộm H&E và H&P cho các mô bệnh học

Các phần gan tụy đã được chuẩn bị và nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (H&E). Tương tự, phần gan tụy được nhuộm bằng Hematoxylin và Phloxine (H&P) thay bước eosin bằng 2% phloxine và nhuộm trong 10 phút (Bell và Lightner, 1988).

Nhuộm CFW của mô gan tụy

Phần parafin được chuẩn bị như trên được tẩy sáp hai lần bằng xylen, được bù nước trong một gradient rượu từ 100% đến 50% và nhuộm bằng dung dịch CFW trong 5–10 phút. Phần nhuộm màu sau đó được khử nước, gắn với nhựa thơm trung tính, kiểm tra và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Các bào tử EHP đã được làm sạch và trong phân được nhuộm bằng CFW cho thấy rõ ràng các vách hình bầu dục có kích thước 1,54±0,15µm×1,09±0,11µm (n = 24) (Hình 1A) và 1,41±0,15µm × 0,99±0,12µm (n = 28) (Hình 1B). Các bào tử EHP rất khó quan sát do sự can thiệp của các tạp chất sau khi phân được nhuộm bằng phloxine. Tế bào nấm Saccharomyces cerevisiae có thể được nhuộm bằng CFW nhưng tế bào nấm men (5,66±1,46µm, n= 30) lớn hơn nhiều so với bào tử EHP. Nghiên cứu cũng đã thử nghiệm các tế bào vi khuẩn bao gồm Lactococcus sp., Staphylococcus sp., Vibrio harveyi với CFW nhưng không bắt màu. Nhuộm CFW cho thấy rõ ràng các hạt bào tử màu trắng xanh sáng trên mặt cắt của gan tụy tôm (Hình 1C).

Hình 1. Quan sát tiêu bản nhuộm Calcofluor – white dưới kính hiển vi huỳnh quang đối với các mẫu: (A) bào tử EHP tinh khiết; (B) phân tôm; (C) mẫu gan tụy.

Một sự khác biệt khác có thể được sử dụng để phân biệt các bào tử EHP, chúng chủ yếu xuất hiện trong các tế bào biểu mô của ống gan tụy, trong khi nấm men và vi khuẩn thường phân tán trong mô hơn là tập trung ở gần các tế bào biểu mô.

Hình 2. Quan sát các phần mô gan tụy Enterocytozoon hepatopenaei của tôm thẻ chân trắng được cố định bằng Davidson’s AFA, được nhuộm bởi H&E (A) và H&P (B) mô bệnh học. Mũi tên trắng cho thấy bào tử, mũi tên đen cho thấy thể vùi ưa bazơ. Thanh = 20 Pha.

Các bào tử EHP cũng được quan sát thấy khi nhuộm H&E của một phần mô bổ sung (Hình 2A) cho thấy sự lây nhiễm EHP trong mô, nhưng các bào tử EHP được nhuộm yếu. Để cải thiện hình ảnh của bào tử trên các phần mô bệnh học, sử dụng Phloxine để thay thế Eosin. Các slide kết quả cung cấp hình ảnh tốt hơn nhiều dưới kính hiển vi huỳnh quang; các bào tử được nhuộm bằng các đốm màu đỏ cam với màu khác biệt với mô (Hình 2B). Các thể vùi bazơ lớn và các bào tử dày đặc màu đỏ cho thấy các giai đoạn phát triển plasmodium giả định của microsporidium (Hình 2B).

Nghiên cứu này cho thấy sự khác nhau của bào tử EHP với quy trình nhuộm H&E trong các bài nghiên cứu trước đây của Praveena & cs., 2018; Tangprasittipap & cs., 2013. Sự khác biệt có thể là do tính thấm của thuốc nhuộm qua thành bào tử, điều này làm kết quả của việc sử dụng các chất cố định và quy trình vận hành khác nhau trong quá trình nhuộm màu giữa các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, sự nhuộm màu của bào tử có thể được cải thiện đáng kể bằng cách thay thế Eosin bằng Phloxine. H&P là một giải pháp thay thế tốt cho nhuộm H&E thông thường cho các nghiên cứu mô bệnh học trong tương lai. Bởi vì thành bào tử chứa chitin, nên nhuộm bằng CFW dẫn đến các bào tử dễ phân biệt hơn so với nhuộm bằng H&E, toluidine blue, phloxine hoặc giemsa, và không bị nhiễu do nhuộm thêm mô và các chất khác. Tín hiệu huỳnh quang là duy nhất và rõ ràng trên nền đen, và rất dễ dàng tìm thấy một bào tử duy nhất trên thực địa.

QUAN ĐIỂM

Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp nhuộm màu để phát hiện và quan sát các bào tử EHP bằng thuốc nhuộm huỳnh quang CFW, được áp dụng rộng rãi cho các loại mẫu khác nhau bao gồm bào tử EHP phân tôm, gan tụy và mẫu mô. Nhuộm CFW có thể được sử dụng trong nhuộm kép để hiển thị các giai đoạn vòng đời của microsporidium (kết quả chưa được công bố). Hơn nữa, phương pháp này ít tốn thời gian hơn và dễ dàng hơn về mặt phương pháp so với phát hiện PCR. Đây là phương pháp sẽ hữu ích để theo dõi quần thể tôm bố mẹ nhiễm EHP tại trại sản xuất tôm giống.

Ngọc Anh (Theo Sciencedirect)